NUEVOS ГЃCIDOS GRASOS OMEGA-3 ENZIMГЃTICOS AC TUALIZACIГ“N CIENTГЌFICA El objetivo principal de esta presentaciГіn es mostrarles nuestra experiencia en el uso de ГЎcidos grasos omega-3 En este sentido conviene inicialmente situar el concepto omega-3 como valor nutricional y terapГ©utico. Es un hecho admitido por la comunidad cientГfica que la ingesta de ГЎcidos grasos poliinsaturados (PUFAs) omega-3 representa un beneficio para la salud en general. Una gran cantidad de estudios con ГЎcidos grasos omega-3 han demostrado su importancia en la dieta, aun cuando estos microalimentos no se consideran esenciales ya que son sintetizados, pero en cantidades excesivamente bajas, para cubrir las necesidades del cuerpo. Diversos estudios bГЎsicos, clГnicos y epidemiolГіgicos han reportado ventajas importantes en la ingesta de ГЎcidos grasos omega-3 en campos tan diversos como cardiologГa, neurologГa, oncologГa, patologГas inflamatorias crГіnicas, oftalmologГa... AdemГЎs, es un componente crГtico para el desarrollo y funcionalidad del cerebro. BENEFICIOS NUTRICIONALES Y TERAPГ‰UTICOS DE LOS OMEGA-3 ESPECIALIDAD MГ‰DICA REDUCCIГ“N EN EL RIESGO O IMPACTO CardiologГa Toda causa de mortalidad, muerte sГєbita cardГaca, isquemia, infarto cerebral, reducciГіn de triglicГ©ridos (especialmente con DHA), aumento de las HDL, pero generalmente no modifica los niveles de lГpidos a dosis bajas, presiГіn arterial y reducciГіn de taquicardias. DermatologГa Soriasis, melanoma. GastroenterologГa CГЎncer de Colon, enfermedad inflamatoria intestinal (Enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa). InmunologГa/Enfermedades infecciosas/NefrologГa Asma, hepatitis, nefropatГas. NeurologГa Enfermedad del Alzheimer (especialmente DHA), demencia, autismo, desorden de falta de atenciГіn-hiperactividad Obstetricia/GinecologГa/ PediatrГa Salud maternal e infantil (especialmente DHA), cognoscitiva (aumento del coeficiente intelectual) y la agudeza visual en reciГ©n nacidos y adolescentes, mejora la duraciГіn del embarazo y el peso del feto, y una gran variedad de otros sГntomas, como por ejemplo la depresiГіn post-parto. OncologГa CГЎncer de mama, colorectal, de endometrio, leucemia, melanoma, de ovario, de pГЎncreas, de prГіstata, renal... Puede mejorar el Гndice terapГ©utico de los citostГЎticos (5-fluorouracilo, ciclofosfamida) e inhibe la caquexia asociada al tumor (reduce pГ©rdida de peso). OftalmologГa DegeneraciГіn Macular asociada a la edad, Renitis Pigmentosa. Ortopedia Osteoporosis/fracturas, inflamaciones de las articulaciones (artritis). PsiquiatrГa DepresiГіn, desorden bipolar, esquizofrenia, desorden de falta de atenciГіn-hiperactividad. ReumatologГa Artritis reumatoide, osteoartritis, osteoporosis. CirugГa Mejora la recuperaciГіn en el post-operatorio, pero hay que tener precauciones en su administraciГіn a altas dosis (> 10 g/g) conjuntamente con anticoagulantes. UrologГa CГЎncer de prГіstata, prostatitis, hiperplasia prostГЎtica benigna. DESVENTAJAS SIN EMBARGO Un reciente meta-anГЎlisis realizado por Hooper et al. ha concluido que no se Los estudios anteriormente citados presentaban diferentes deficiencias en su ha podido documentar, de manera objetiva y estadГsticamente significativa, planteamiento relacionadas con la no separaciГіn de las intervenciones reali- un efecto beneficioso en el consumo de PUFAs omega-3 en la mortalidad rela- zadas con los diferentes ГЎcidos omega-3 o mezclas de los mismos en forma de cionada con eventos cardiovasculares o cГЎncer 1. aceite de pescado o suplementos alimenticios enriquecidos. Tampoco se ha documentado, de manera objetiva y estadГsticamente signifi- TambiГ©n se ha observado una falta de homogeneidad en cuanto a la duraciГіn cativa, el efecto de los omega-3 en la reducciГіn del riesgo de desarrollar cГЎn- y las dosis en cada tratamiento. cer2. AsГ como tampoco se ha valorado la importancia de la estructura quГmica en la que se ha administrado el ГЎcido omega-3: triglicГ©rido (TG), Г©ster etГlico (EE) o ГЎcido graso libre (FA). 1 Hooper L. et al. Risks and benefits of omega 3 fats for mortality, cardiovascular disease and cancer: systematic review. BMJ 2006; 332:752-760; Balk E.M. et al. Effects of omega-3 fatty acids on serum markers of cardiovascular disease risk: A systematic review. Atherosclerosis 2006; 189:19-30. 2 MacLean CH et al. Effects of omega-3 fatty acids on cancer risk: a systematic review. JAMA 2006; 295:403-15) RECOMENDACIONES Teniendo en cuenta esta controversia, la opiniГіn de diferentes expertos es que deberГan mantenerse las actuales recomendaciones en el consumo de ГЎcidos grasos omega-3 pero teniendo en cuenta una serie de criterios que deberГan cumplir los ГЎcidos grasos omega-3 para su aplicaciГіn nutricional y terapГ©utica, como son: О‡ Manufacturar los PUFAs omega-3 siguiendo los criterios similares a los estГЎndares farmacГ©uticos que incluyen controles de calidad en todas las etapas de producciГіn para asegurar su pureza y calidad. О‡ Utilizar compuestos con un contenido mГnimo de 60% en PUFA omega-3 de todos los ГЎcidos grasos. О‡ La relaciГіn omega-3/omega-6 debe ser mayor de 50:1. Estas recomendaciones estГЎn de acuerdo con las conclusiones de un workshop sobre ГЎcidos grasos omega-3 recientemente publicadas en la revista Journal American Clinical Nutrition, que ademГЎs destaca como punto importante la necesidad de realizar mГЎs ensayos clГnicos que permitan calibrar el potencial real de los ГЎcidos grasos omega-3 tanto a nivel preventivo como terapГ©utico. ВїQUГ‰ ГЃCIDO GRASO OMEGA-3? De acuerdo con estos criterios el primer punto a resolver es la elecciГіn del PUFA omega-3 mГЎs adecuado para un determinado tratamiento. Los tres ГЎci25 dos grasos de la serie 3 mГЎs importantes, fisiolГіgicamente hablando, son: g/100 g 20 О‡ El alfa-linolГ©nico (ALA) О‡ El eicosapentaenoico (EPA) 15 О‡ El docosahexaenoico (DHA) 10 El DHA es el ГЎcido graso omega-3 mГЎs abundante en las membranas y estГЎ 5 presente en todos los Гіrganos. Es particularmente el mГЎs abundante en el sistema nervioso central, en el esperma y en la retina, ademГЎs del mГЎs variable 0 se R al t ec m liu po i Ad e ith ep Ch e ek rt cle a He M us er Liv Sp le en BC R r Ce co al r b x rte em Sp na ti Re entre los Гіrganos. SГіlo pequeГ±as cantidades de ALA y de EPA estГЎn presentes en los tejidos, y el contenido en DHA es habitualmente entre 5-30 veces superior al del EPA en ALA EPA DHA Estudio transversal del contenido en ГЎcidos grasos en tejidos de adultos de Estados Unidos, CanadГЎ, Australia y Europa. la mayorГa de los Гіrganos. AdemГЎs, el DHA es unas 100 veces mГЎs abundante que el EPA en el cerebro y la retina. ВїQUГ‰ ГЃCIDO GRASO OMEGA-3? Aunque los tres ГЎcidos grasos estГЎn relacionados metabГіlicamente, diversos estudios han demostrado que la administraciГіn de ALA no genera las cantidades fisio- О±-Linolenic acid (18:3n-3) lГіgicas necesarias de DHA y de EPA. En cuanto a la administraciГіn de DHA o EPA, las Гєltimas recomendaciones sugieren que la vГa mГЎs eficiente para el incremento de las concentraciones de un ГЎcido omega-3 es la administraciГіn de dicho ГЎcido especГfi- Stearidonic (18:4n-3) camente. De todas maneras en un planteamiento mГЎs general la administraciГіn de DHA garantiza una concentraciГіn bГЎsica de EPA, mientras que la administraciГіn (20:4n-3) exclusiva de este Гєltimo disminuye la concentraciГіn de DHA. En humanos, la capacidad endГіgena de convertir ALA en DHA o EPA es muy baja EPA (20:5n-3) o inexistente, por esta razГіn, el consumo de DHA en la dieta puede ser crГtico para mantener la concentraciГіn adecuada de DHA en las membranas celulares. BrJ DPA (22:5n-3) Nutr2002; 88:355–363. RetroconversiГіn de DHA-EPA: en el grupo de DHA, su concentraciГіn aumento un DHA (22:6n-3) 69% y la del EPA un 29%. En el grupo de EPA, este creciГі un 297% mientras que el DHA decreciГі un 15%. AmJ ClinNutr1997; 66:649-59/ AmJ ClinNutr2000; 71:1085–94/ Am J Clin Nutr 2004;79:765–73. ВїQUГ‰ ГЃCIDO GRASO OMEGA-3? El DHA es el ГЎcido graso n-3 en el sistema nervioso central. Por otra parte desde un punto de vista nutricional, cuyo objetivo es el de recuperar los depГіsitos de ГЎcidos grasos omega-3, la administraciГіn de DHA garantiza una intervenciГіn en el sistema nervioso central ya que la concentraciГіn de EPA en este tejido es puramente testimonial. Dietas que contienen un 9,5% de DHA, inhiben completamente la degeneraciГіn de la retina inducida por la N-Metil-N-nitrosourea, en cambio las dietas que contienen un 4,75% de DHA (grupo EPA+DHA) o sГіlo EPA no tuvieron un efecto protector. Exp Eye Res 2003; 77:167–173. El DHA es el precursor de los docosatrienos y las resolvinas de la serie D que regulan los procesos asociados a la inflamaciГіn y su resoluciГіn final. J Biol Chem 2003; 278:14677–14687. El DHA hidrolizado de los fosfolГpidos de membrana es el precursor endГіgeno de la respuesta neuroprotectiva frente reperfusiГіn isquГ©mica. J Biol Chem 2003; 278: 43807–43817. La sГntesis del 10,17S-docosatrieno, neuroprotectina D1, protege a las cГ©lulas de la retina de la apoptosis inducida por estrГ©s oxidativo, de una manera similar se sugiere que protegerГЎ a las neuronas. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 8491–8496. BIODISPONIBILIDAD Otro aspecto interesante que puede condicionar la eficacia de un determinado tratamiento es la biodisponibilidad de los ГЎcidos omega-3. Existen numerosos estudios en animales que han demostrado que los glicГ©ridos son los CONTENIDO EN PUFA N-3 (%) BIODISPONIBILIDAD* 25-30% 74-100% Г‰steres etГlicos >85% 21-57% ГЃcidos grasos libres >65% 51% min 70-75% 98% TIPO DE ACEITE Aceite de pescado TriglicГ©ridos Re-esterificados transportadores mГЎs eficaces para los ГЎcidos grasos. AdemГЎs los glicГ©ridos se consideran la forma quГmica mГЎs favorable desde un punto de vista alimentario, superior a los Г©steres etГlicos de ГЎcidos grasos insaturados los cuales presentan una absorciГіn intestinal deteriorada de los ГЎcidos grasos n-3 observados como se ha demostrado en animales de laboratorio. TambiГ©n se ha demostrado que los Г©steres etГlicos de ГЎcidos grasos no saturados se hidrolizan a una velocidad mГЎs lenta que los glicГ©ridos correspondientes. Un estudio en humanos realizado por la empresa farmacГ©utica SIGMA-TAU En un estudio In vivo en 24 personas sanas comparando una sola toma oral de PUFAs n-3 en estructuras quГmicas diferentes, se demostrГі un mayor nivel plasmГЎtico de PUFAs n-3 en el grupo tratado con aceite re-esterificado. demostrГі que los triglicГ©ridos obtenidos por reesterificaciГіn presentan una *ExtraГdo de una publicaciГіn de la empresa SIGMA-TAU. de los ГЎcidos grasos libres; que ademГЎs generan problemas digestivos; y tam- biodisponibilidad similar al aceite de pescado natural y muy superior a la biГ©n superior a la de los Г©steres etГlicos, cuya Гєnica ventaja es la pureza que se puede alcanzar pero por contra generan etanol que puede ser tГіxico a dosis elevadas. 10 BIOACTIVIDAD - SEGURIDAD DHA TG QUГЌMICO ALGATRIUM PLUS La sГntesis industrial de triglicГ©ridos se puede realizar quГmicamente o por vГa enzimГЎtica. Las diferencias en las condiciones de reacciГіn entre un pro- • pH extremos • Temperaturas altas (destilaciГіn) • Reactivos quГmicos • pH fisiolГіgico • Temperaturas bajas • Sin reactivos quГmicos ceso de sГntesis quГmico y uno enzimГЎtico determinarГЎn las calidades finales para cada producto. El uso de mГ©todos tradicionales quГmicos (separaciГіn cromatogrГЎfica, destilaciГіn molecular, etc.) para producir concentrados de PUFAs omega-3 implican el uso de pHs extremos y de altas temperaturas, que • Nivel bajo de triglicГ©ridos • Productos de reacciГіn secundarios • PurificaciГіn cromatogrГЎfica • Nivel alto de triglicГ©ridos • Sin productos secundarios • No necesita mГЎs purificaciГіn pueden destruir parcialmente la estructura de los dobles enlaces todos cis del PUFA omega-3 natural por oxidaciГіn, isomerizaciГіn o migraciГіn. Por otra parte, las condiciones suaves (temperatura menor de 50В°C, pH 6-8, y menos productos quГmicos) usadas en la hidrГіlisis enzimГЎtica proporcionan • MigraciГіn de dobles enlaces • OxidaciГіn de dobles enlaces • Isomerizaciones Cis/Trans • PreservaciГіn de dobles enlaces • No oxidaciГіn de dobles enlaces • No isomerizaciones Cis/ Trans un alternativa prometedora que podrГa tambiГ©n ahorrar energГa y aumentar la selectividad del producto. La preservaciГіn de los enlaces dobles, conferirГЎ a la molГ©cula una mayor bioactividad. ALGATRIUM PLUS ESPECIFICACIГ“N Acidez Contenido antioxidante UNIDADES LГЌMITES mg KOH/g 3.0 mГЎx. g/100g 1.0 - 1.1 Muchos estudios demuestran que la bioactividad de los aceites omega-3, y principalmente del DHA, estГЎ relacionada directamente con su contenido respecto a los ГЎcidos grasos totales, los cuГЎles pueden competir con los omega-3 Densidad a 20ВєC Kg/l 0.930 - 0.940 ГЃcido graso DHA (C22 :6n3) %FA 70 mГn. ГЃcido graso DPA (C22 :5n3) %FA 8 mГЎx. ГЃcido graso EPA (C20 :5n3) %FA 10 mГЎx. ГЃcidos grasos Omega-3 %FA 85 mГn. meq O2/Kg 5.0 mГЎx. g/100g 0.10 mГЎx. ГЌndice de PerГіxidos Residuo seco Especificaciones del aceite omega-3 utilizado en estos estudios. 12 en un metabolismo concreto. Para obtener el mГЎximo nivel de bioactividad, Brudy ha dirigido sus esfuerzos en dos objetivos bГЎsicos: О‡ Tener el mГЎximo contenido de DHA en el triglicГ©rido. О‡ Reducir al mГЎximo el contenido de EPA. AdemГЎs, este aceite cumple todos los requisitos legales en cuanto a Гndice de perГіxidos, acidez, contenido antioxidante, nivel de metales pesados… ALGATRIUM PLUS 90 80 De todos los aceites que hay en el mercado, Algatrium Plus (DHA 70e) es 70 el aceite enriquecido con un contenido en omega-3 global y en DHA mГЎs 60 alto. 50 40 DPA 30 EPA 20 Algatrium Plus 10 OMEGA-3 0 P M HSO Comparativa de diferentes aceites omega-3 en el mercado. DHA 50CHEM ALGATRIUM PLUS ALGATRIUM PLUS OMEGA-3 % OMEGA-3 SГЌNTESIS INSA MG DG CHOL PLM TG EE GTOTAL A. PLUS 70 ENZIMГЃTICO 0,5 n.d. 7,1 n.d. n.d. 86,5 5,9 93,6 FISH 20 ATГљN 4,7 n.d. 2,2 4,2 n.d. 88,9 n.d. 91,1 DHA 50 QUГЌMICO 2,7 4,3 10,3 3,5 22,8 40,1 14,0 53,2 DHA 50 QUГЌMICOPURIFICADO 2,1 n.d. 18,8 n.d. n.d. 66,4 5,2 85,2 Especificaciones del aceite omega-3 utilizado en estos estudios. 14 La biodisponibilidad del aceite es directamente pro- 90% de glicГ©ridos totales, con un 85% en forma de porcional al tipo de molГ©culas que lo compongan, triglicГ©ridos y sin monoglicГ©ridos). El DHA obteni- concretamente a su composiciГіn lipГdica. Los acei- do quГmicamente tiene un nivel bajo de triglicГ©ri- tes naturales contienen mГЎs del 90% de materia en dos (<50%), un mayor nivel de Г©steres etГlicos y un forma de glicГ©rido, que proporciona una biodispo- alto contenido de polГmeros (15-20%), que no son nibilidad mГЎxima. Algatrium Plus es muy similar a absorbibles y que se deben eliminar por cromatogra- un aceite natural (la composiciГіn lipГdica incluye un fГa en columna (QUГЌMICO-PURIFICADO). LEGISLACIГ“N 100 90 Solamente los aceites de pescado o de algas naturales que no se han rees- 80 terificado satisfacen la legislaciГіn alimentaria en cuanto a su composiciГіn, 70 y por lo tanto son un alimento. El DHA obtenido quГmicamente no satisface los 60 requisitos de la farmacopea europea, sobretodo relacionado con el nivel de 50 triglicГ©ridos, glicГ©ridos totales y en el contenido en compuestos polimГ©ricos. 40 Es necesaria una purificaciГіn por cromatografГa en columna para que el producto cumpla los requisitos de la legislaciГіn europea. Algatrium Plus tiene la 30 misma composiciГіn que los aceites naturales y por lo tanto se consideran 20 un alimento. 10 0 INS. MG ComposiciГіn estructural. DG PLM FA TG EE GTotal Algatrium Plus Farmacopea DHA 50% QUГЌMICO DHA 50% QUГЌMICO-PURIFICADO ACTIVIDAD ANTITUMORAL COMPOSICIГ“N ESTRUCTURA IC50 (ОјM) CГ‰LULAS SANAS CГ‰LULAS TUMORALES RELACIГ“N DE SEGURIDAD %DHA PIEL RENAL HeLa FA 70 123,1 В±9,0 n.d. 72,2 В±5,8 1,7 EE 70 566,3 В±53,9 72,6 В±8,3 71,0 В±9,7 7,98 -1,02 TG (Algatrium Plus) 70 716,7 В±41,9 392,7 В±37,5 58,6 В±8,8 12,23 -6,70 TG (QuГmico) 50 1956,0 В±27,8 413,6 В±25,6 564,0 В±69,6 3,47 -0,73 TG (Pescado) 20 2267,6 В±27,9 3116,0 В±158,2 1379,4 В±286,4 1,64 -2,26 Efectos del contenido en DHA y de la estructura quГmica. Toxicidad celular. Para valorar la actividad de Algatrium Plus, nuestro primer obje- el triglicГ©rido (TG). Pero, en cГ©lulas renales sanas, el EE tiene la mis- tivo fue determinar su capacidad citotГіxica antitumoral. En este ma toxicidad que en las cГ©lulas tumorales y en las cГ©lulas de piel, el sentido realizamos un estudio comparativo usando cГ©lulas tumo- FA demuestran una gran toxicidad, siendo los TG, la forma con un rales (HeLa) y cГ©lulas sanas como control (renales y de piel). Hemos mejor cociente de seguridad. Para una misma estructura quГmica, realizado estudios dosis-respuesta para determinar el valor de IC50 el TG, una disminuciГіn del contenido en DHA a 50 o al 20% (este como criterio de toxicidad (es la concentraciГіn que mata al 50% de Гєltimo es la concentraciГіn en el aceite de pescado), disminuye de las cГ©lulas). Hemos analizado dos variables, el efecto de la estructu- forma dramГЎtica el efecto citotГіxico en las cГ©lulas del tumor. Estos ra del lГpido y del contenido en DHA. Para un contenido en DHA del resultados demuestran que la forma Гіptima es el triglicГ©rido con 70% de todos los ГЎcidos grasos, se obtuvo la misma toxicidad en un alto contenido en DHA (Algatrium Plus). cГ©lulas tumorales con el Г©ster etГlico (EE), el ГЎcido graso libre (FA) o 16 ACTIVIDAD COMO ADYUVANTE ANTITUMORAL LГЌNEA CELULAR SISTEMA DE ADICIГ“N ALGATRIUM PLUS ОјM IC50 (ОјM) 0 295,3 В±31,6 (n=8) 1 5 10 30,1 В±5,4 (n=8) 28,7 В±6,7 (n=8) 37,0 В±4,4 (n=6) SimultГЎneo 5 184,3 В±16,2 (n=4) Control 0 23.30 В±3.68 (n=12) Pre-incorporado 1 5 10 2.80 В±1.10 (n=7) 2.38 В±1.01 (n=4) 3.80 В±1.42 (n=6) SimultГЎneo 5 14.80 В±8.01 (n=6) Control HeLa-Epitelial (Dox) Pre-incorporado HT-29-Colon (5-FU) Efecto del DHA sobre la actividad antitumoral de la Doxorrubicina o del 5-fluoroacilo. Toxicidad celular. CONTENIDO EN DHA Control DHA Algatrium Plus DHA TG 50 QuГmico DHA TG 20 Pescado IC50 (nM) DHA (ОјM) CГ‰LULA TUMORAL CГ‰LULA SANA 0 295,3 В±31,6 1158,6 В±369,9 5 28,7 В±6,7 1046,6 В±230,4 10 37,0 В±4,4 1080,5 В±174,2 5 130,9 В±15,6 1163,3 В±156,9 10 106,3 В±20,7 980,1 В±270,9 5 257,4 В±29,6 1157,5 В±124,9 10 236,5 В±15,7 1530,3 В±481,3 Efecto del contenido en dha sobre la actividad antitumoral de la doxorrubicina. Toxicidad celular. Otra actividad interesante de los PUFAs omega-3 en cГЎncer, es su uso como Este efecto potenciador depende del contenido en DHA, ya que con el uso de adyuvantes en la quimioterapia convencional. En este sentido, determina- un aceite quГmico (50% en DHA) o de aceite de pescado (20% en DHA), se pier- mos los efectos de Algatrium Plus a concentraciones subtГіxicas sobre la toxi- de progresivamente dicho efecto potenciador. TambiГ©n es significativo que cidad de la Doxorrubicina y del 5-fluoroacilo. La exposiciГіn simultГЎnea de las este efecto no incrementa la toxicidad de los citostГЎticos en cГ©lulas sanas. cГ©lulas tumorales al DHA y a la droga aumenta la toxicidad de la misma dos veces (disminuye el valor de la IC50). Por otra parte, si Algatrium Plus se ha incorporado previamente a la membrana celular, este efecto potenciador aumenta hasta 10 veces. BIOACTIVIDAD - SEGURIDAD ВїACTIVIDAD PRO-O ANTIOXIDANTE? En los sistemas quГmicos puros, las molГ©culas mГЎs susceptibles al ataque de los radicales libres son los ГЎcidos grasos poliinsaturados (PUFAs) como el ГЎcido docosahexaenoico (DHA, 22:6 n-3) y, en general, esta susceptibilidad aumenta con el nГєmero de dobles enlaces. In vivo, se supone el mismo comportamiento. Entonces, Вїpor quГ© el DHA, una diana molecular de los radiaciones libres, es el ГЎcido graso mГЎs abundante en tejidos expuestos a un potencial estrГ©s oxidativo como la retina o en tejidos con un sistema antioxidante celular deficiente como el sistema nervioso central? 18 BIOACTIVIDAD - SEGURIDAD En este contexto, hemos estudiado la influencia de la presencia del DHA enzimГЎtico en la membrana celular, sobre la generaciГіn intracelular de radicales libres utilizando como sistema experimental dos lГneas celulares humanas sanas, fibroblastos de piel (Foreskin, ATC CRL 2076) y cГ©lulas epiteliales pigmentarias de la retina (ARPE-19, ATCC CRL 2302). La cuantificaciГіn de los radicales libres generados se ha realizado mediante metodologГas fluorescentes usando sondas moleculares como el H2DCF-DA, DHR y DHE. Como inductores exГіgenos de estrГ©s oxidativo se ha utilizado el AAPH y el sistema xantina/xantin oxidasa, y como inductores endГіgenos, la rotenona y la antimicina A. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE CELULAR CГ‰LULAS DE PIEL Fluorescencia (UA) H2DCF-DA Fluorescencia (UA) CГ‰LULAS DE RETINA -49% 0 50 100 150 200 Tiempo (min.) 250 -42% Como se muestra en la figura, la presencia de Algatrium Plus en la membrana celular disminuye la generaciГіn intracelular de radicales libres despuГ©s de estar sometidas las cГ©lulas a un estrГ©s oxidativo. Este comportamiento es independiente de la cГ©lula en estudio (piel o 0 50 100 150 Tiempo (min.) retina) y del marcador utilizado (H2DCF-DA o DHR), lo cual nos indica la 200 activaciГіn de un mecanismo general. El nivel de protecciГіn observado Fluorescencia (UA) DHR Fluorescencia (UA) tambiГ©n es similar frente al mismo estГmulo oxidativo. -56% -50% Control Algatrium Plus 0 20 50 100 150 200 Tiempo (min.) 250 0 50 100 150 200 Tiempo (min.) 250 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE CELULAR INDEPENDIENTE DEL INDUCTOR % ProtecciГіn 60 50 proceso general, cambiamos el inductor de estrГ©s oxidativo de un produc- 20 to quГmico (el AAPH) a un sistema enzimГЎtico (sistema X/XO) o inductores 10 0 CГ‰LULAS DE RETINA Para determinar que la protecciГіn antioxidante de Algatrium Plus era un 40 30 endГіgenos (ROT y ANT A). Se ha observado el mismo comportamiento en AAPH ROT ANT A X/XO todos los casos. Incremento% ProtecciГіn -49% 0 50 100 150 200 Tiempo (min.) 250 1,8 1,5 1,2 El efecto antioxidante de Algatrium Plus depende de la dosis, mostrando un comportamiento dosis-dependiente a la inversa. El mayor efecto se ha 0,9 observado en una concentraciГіn baja de DHA, mientras que a altas con- 0,6 0,3 0 centraciones, el efecto antioxidante disminuye independientemente de la 0,5 Algatrium Plus 5 DEPENDENCIA DE LA DOSIS 60 % ProtecciГіn Fluorescencia (UA) EFECTO ADITIVO 2,1 potencia del estrГ©s oxidativo. TambiГ©n, el efecto antioxidante de Algatrium Plus presenta un efecto aditivo con la frecuencia de la administraciГіn. La administraciГіn de una do- 50 sis diaria inrementa el efecto antioxidante respecto a una sola administra- 40 30 ciГіn. 20 10 0 0,5 5 Algatrium Plus 50 Dosis diaria Una dosis ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE CELULAR CONTROL ALGATRIUM PLUS 0,5 ОјM T= 0 min. La generaciГіn intracelular de radicales libres se confirmГі mediante microscopia de fluorescencia confocal. Las micrografГas muestran una acumulaciГіn progresiva en el tiempo de radicales libres en las cГ©lulas T= 15 min. control sin DHA, mientras que en las que han incorporado Algatrium Plus en su membrana, el nivel intracelular de radicales libres no ha aumentado. T= 30 min. CГ‰LULAS DE PIEL 22 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE CELULAR 60 A nivel celular, la generaciГіn de radicales libres parece ser dependiente de la composiciГіn en ГЎcidos grasos de la cГ©lula, pero la influencia especГfica de CГ‰LULAS DE PIEL % PROTECCIГ“N 40 cada clase de ГЎcido graso no ha sido estudiada. 20 Por otra parte, a nivel industrial, el mГ©todo de sГntesis usado para obtener 0 el aceite enriquecido en DHA puede ser muy importante en la calidad final -20 del producto. En este sentido hemos estudiado la importancia del contenido de DHA y del origen sintГ©tico en el efecto antioxidante. -40 ACEITE DE PESCADO DHA TG50 QUГЌMICO ALGATRIUM PLUS Como se puede observar en la figura, una disminuciГіn del contenido en DHA al 50% (origen quГmico) o al 20% (aceite de pescado) de los ГЎcidos grasos to- 60 tales, induce una disminuciГіn del efecto antioxidante en las cГ©lulas de retina, CГ‰LULAS DE RETINA % PROTECCIГ“N aunque en ningГєn caso llega a ser pro-oxidante. Sin embargo, en cГ©lulas de piel, esta reducciГіn es tan acusada que sГіlo Algatrium Plus es antioxidante, 40 siendo los otros dos pro-oxidantes. 0,5 ОјM 20 5 ОјM 50 ОјM 0 ACEITE DE PESCADO DHA quГmico vs. Algatrium Plus. DHA TG50 QUГЌMICO ALGATRIUM PLUS Dado el carГЎcter multifactorial de un tratamiento nutricional, no es aconsejable administrar un producto que presente actividades divergentes en funciГіn del tejido al que se incorpore. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE CELULAR CГ‰LULAS DE RETINA % PROTECCIГ“N 60 Si la baja actividad del aceite de origen quГmico (50% en DHA), pudie- 50 ra estar relacionado con la presencia de estructuras polimГ©ricas, su eli- 40 minaciГіn por cromatografГa en columna deberГa permitir recuperar su actividad antioxidante. Como se puede observar en la figura, una mani- 30 pulaciГіn excesiva del producto original para eliminar contaminantes 20 o para mejorar sus caracterГsticas organolГ©pticas se traduce en una 10 pГ©rdida de bioactividad. 0 -10 ALGATRIUM PLUS DHA TG50 QUГЌMICO (DHA) DHA TG50 QUГЌMICO PURIFICADO 0,5 ОјM 5 ОјM 50 ОјM DHA quГmico vs. Algatrium Plus. 24 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE CELULAR CГ‰LULAS DE RETINA 70 La actividad antioxidante del Algatrium Plus, tambiГ©n esta relacionada % PROTECCIГ“N 60 con su mayor biodisponibilidad ya que un Г©ster etГlico o un ГЎcido graso 50 libre con el mismo contenido en DHA, presenta una actividad antioxi- 40 dante como mГЎximo la mitad de la de Algatrium Plus. 30 20 10 0 0,5 ОјM 5 ОјM (DHA) Efecto de la estructura quГmica Fa vs. Ee vs. Tg FA-BSA FA: ГЃcido graso libre Algatrium Plus EE: Г‰ster etГlico TG 50 CHEM TG: TriglicГ©rido EE 70 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE CELULAR CГ‰LULAS DE RETINA 60 % PROTECCIГ“N 50 Comparado con los antioxidantes normalmente utilizados en tratamientos oculares a las concentraciones Гіptimas descritas, Algatrium Plus pre- 40 senta a todas las dosis estudiadas un efecto superior. 30 20 10 0 s um ri at g Al u Pl M C NA m Algatrium Plus vs. antioxidantes 26 s1 Cy M m 0 Co Q 10 ОјM 0 t Vi 0 E1 ОјM 0 t Vi C 10 ОјM ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE CELULAR CГ‰LULAS DE RETINA 60 % PROTECCIГ“N 50 Incluso si estos antioxidantes se combinan o se incrementa su concentraciГіn 10 Гі 100 veces. 40 30 20 10 0 s um tri ga u Pl T1 AN Al Algatrium Plus vs. antioxidantes AN T1 0 x1 0 T1 AN 0 x1 T2 AN BIOACTIVIDAD En este punto, la cuestiГіn es: ВїCuГЎl es el mecanismo por el cual el Algatrium Plus ejerce este efecto antioxidante tan potente? Los Omega-3 pueden actuar a diferentes niveles en la fisiologГa celular. La defensa antioxidante celular se basa en la actividad de un nГєmero de enzimas antioxidantes, junto con otros antioxidantes quГmicos; conjuntamente previenen la peroxidaciГіn lipГdica, la proteГca y el daГ±o en DNA. Hemos estudiado el efecto de Algatrium Plus en diversos aspectos del sistema antioxidante celular: О‡ GeneraciГіn del aniГіn superГіxido (O2-) О‡ La actividad superГіxido dismutasa (SOD) y de la glutatiГіn peroxidasa (GPx) О‡ La concentraciГіn intracelular de glutatiГіn (GSH) О‡ La peroxidaciГіn lipГdica. О‡ Y el daГ±o en DNA. 28 BIOACTIVIDAD 1. Cellular Respiration Oxidative Burst O2- 2. SOD e s ala t Ca H2O2 H2O + O2 GPx H2O GSH Environmental Factors Protein Peroxidation Mecanismo de actividad antioxidante. 3. GSSG GRed OH 4. DNA Damage Lipid Peroxidation BIOACTIVIDAD 1. Cellular Respiration Oxidative Burst O2- 2. SOD e s ala t Ca H2O2 H2O + O2 GPx = GSH + Environmental Factors Protein Peroxidation Mecanismo de actividad antioxidante. 30 3. H2O GSSG GRed OH 4. DNA Damage Lipid Peroxidation BIOACTIVIDAD Hemos encontrado que la incorporaciГіn de Algatrium Plus en las cГ©lulas disminuye la generaciГіn del aniГіn superГіxido, la peroxidaciГіn lipГdica de una manera dosis-dependiente inversa y el daГ±o en DNA. Los niveles inferiores del aniГіn superГіxido bajo estrГ©s oxidativo en cГ©lulas tratadas con Algatrium Plus puede ser debido a la actividad mГЎs alta de la SOD respecto al control. Por otra parte, la actividad de la GPx en las cГ©lulas tratadas no era diferente de las cГ©lulas control con o sin estrГ©s oxidativo. El cambio mГЎs significativo fue el incremento (300%) de la concentraciГіn intracelular de GSH, relacionado con un incremento de la sГntesis de novo. Estos resultados nos indican que Algatrium Plus ejerce su efecto antioxidante mediante un incremento de la actividad del sistema antioxidante celular, sin una participaciГіn directa en el mismo que lo diferencia de los antioxidantes quГmicos convencionales. Esto sugiere que las cГ©lulas toleran cantidades pequeГ±as de DHA y que Г©ste actГєa a modo de estГmulo para evitar cualquier acumulaciГіn de radicales libres, la incorporaciГіn de Algatrium Plus en las biomembranes provoca una respuesta celular antioxidante adaptativa. ESTUDIOS IN VIVO Para dar credibilidad a los resultados obtenidos in vitro es necesario una Para valorar la acciГіn de Algatrium Plus, se utilizГі como modelo de es- constataciГіn de los mismos in vivo. En este sentido se ha desarrollado trГ©s oxidativo el inducido por el ejercicio fГsico aerobio. un ensayo clГnico, controlado cruzadov de 4 meses de duraciГіn (N = 40 deportistas), a una dosis de 2 g/dГa de Algatrium Plus. Se sometiГі a deportistas a un esfuerzo continuado al 75% de su consumo mГЎximo de oxГgeno durante 90 minutos, lo cual supone una produc- 32 Las variables a estudiar fueron el daГ±o en DNA y parГЎmetros antioxidan- ciГіn suficiente de radicales libres y estrГ©s oxidativo como para conocer tes sГ©ricos. la capacidad antioxidante de cualquier manipulaciГіn dietГ©tica. ESTUDIOS IN VIVO CAPACIDAD ANTIOXIDANTE TOTAL Se observГі un aumento estadГsticamente significativo en la capacidad 2,00 antioxidante total del serum (p<0,05) antes y despuГ©s de la realizaciГіn H2O2 (nmol/L min.) 1,90 de las pruebas rectangulares en los deportistas que habГan ingerido Algatrium Plus durante un periodo de tres semanas a cuatro meses. 1,80 1.70 Algatrium Plus 1,60 Control 1,50 BASAL 20 DГЌAS ParГЎmetros antioxidantes in vivo. 4 MESES ESTUDIOS IN VIVO PEROXIDACIГ“N LIPГЌDICA 60 El nivel plasmГЎtico de MDA como Гndice de peroxidaciГіn lipГdica fue 50 aumentando durante la realizaciГіn de todas las pruebas de esfuerzo MDA (nmol/L) 40 (p<0,035). DespuГ©s de la ingesta de Algatrium Plus durante 3 semanas, 30 el daГ±o oxidativo a nivel lipГdico en las mismas condiciones disminuye 20 prГЎcticamente a nivel basal (p<0,05); observГЎndose a los 4 meses de tra- 10 tamiento un efecto protector en esta variable. 0 -10 BASAL 20 DГЌAS ParГЎmetros antioxidantes in vivo. 34 4 MESES ESTUDIOS IN VIVO DAГ‘O MOLECULAR EN EL DNA 900 8-oxo-dG (pmol/Kgx24h.) 800 Hay un aumento en el daГ±o oxidativo del DNA durante la realizaciГіn de 700 600 las pruebas rectangulares del esfuerzo medidas como el nivel de 8-oxo- 500 dG en la orina (p<0,011). La ingesta de Algatrium Plus durante 3 sema- 400 nas y hasta 4 meses protege el DNA del daГ±o oxidativo inducido por el 300 esfuerzo de una manera significativa (p<0,035). 200 100 0 BASAL 20 DГЌAS ParГЎmetros antioxidantes in vivo. 4 MESES ESTUDIOS IN VIVO VARIACIГ“N EN LA CONCENTRACIГ“N DE GLUCOSA 4 2 Como efectos colaterales en el rendimiento deportivo se ha observado que los niveles de glicemia disminuyen durante la realizaciГіn de la prue- mg/dL 0 ba rectangular de esfuerzo (p<0,0009). Esta reducciГіn en la glicemia era menor despuГ©s de 3 semanas de ingesta de Algatrium Plus se traducГa -2 en un aumento del nivel de glicemia a los 4 meses de tratamiento con Algatrium Plus. -4 -6 -8 BASAL 3 SEMANAS Variables fisiolГіgicas de rendimiento deportivo. 36 4 MESES ESTUDIOS IN VIVO CONSUMO DE OXГЌGENO 2900 2850 TambiГ©n se ha observado un aumento significativo del consumo absoluto (p<0,019) y relativo (p<0,036) de oxГgeno determinado en el umbral 2800 mL/min. del esfuerzo triangular con la ingesta de Algatrium Plus hasta 4 meses. 2750 Estos resultados parecen indicar que la ingesta de Algatrium PLus pue- 2700 de incrementar el rendimiento deportivo. 2650 2600 2550 BASAL 3 SEMANAS Variables fisiolГіgicas de rendimiento deportivo. 4 MESES CONCLUSIONES Los ГЎcidos grasos omega-3 son un concepto vigente tanto desde un punto de vista nutricional como terapГ©utico con un alto potencial de desarrollo. La aplicaciГіn de los ГЎcidos grasos omega-3 en estos campos requiere de productos manufacturados de acuerdo con los estГЎndares que se aplican a productos farmacГ©uticos que incluyen controles de calidad para asegurar su pureza y calidad estructural que condiciona su bioactividad. Como estГЎndar es exigible una riqueza mГnima superior al 65% en una estructura quГmica muy biodisponible como un triglicГ©rido. La incorporaciГіn de Algatrium Plus en las membranas celulares no sГіlo no promueve la peroxidaciГіn lipГdica sino que actГєa como un activador del sistema antioxidante celular probablemente como consecuencia de una respuesta adaptativa de la cГ©lula. 38 INFORMACIГ“N LEGAL ALGATRIUM es una Marca Internacional propiedad de BRUDY TECHNOLOGY. El uso de DHA de alta concentraciГіn para el tratamiento de enfermedades tumorales estГЎ protegido por la Patente Internacional nВє200501141 Propiedad de BRUDY TECHNOLOGY. La comercializaciГіn y el uso de Omega-3 Antioxidantes estГЎ protegido por la Patente Internacional nВє200503202 propiedad de BRUDY TECHNOLOGY. Dr. Joan C. Domingo Pedrol - Departamento de BioquГmica y BiologГa Molecular - Universidad de Barcelona - Telf. 934 021 214 - e-mail: jcdomingo@ub.edu Fabricado en EspaГ±a por: Brudy Technology - C/Riera de Sant Miquel, 3 - 2Вє 4ВЄ - 08006 Barcelona - Tel. 93 217 03 66
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