HLA-DQ2 / HLA-DQ8 Celiac Disease REF: RT-59 Genotyping of HLA DQ2 and HLA-DQ8 INTRODUCTION AND PURPOSE OF USE The Celiac Disease system is a test that allows the identification of HLA DQ2 and DQ8 aplotypes, by means of Real Time PCR, specifically it performs the genotyping of alleles: HLA DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05 and DQB1*02, DQB1*0302, after genomic DNA extraction from biological samples. The Procedure allows the detection of the DNA target by means a genomic amplification reaction. The analysis of the results is made by an instrument of Real Time PCR, composed by a thermal cycler with a system of fluorescence detection. CONTENT The kit contains reagents enough to perform 48 amplification tests: R1 R2 R3 Quantity Description 3 x 430 µl Amplification mMix dNTPs, Tris-HCl, KCl, MgCl2, Taq Polymerase, Nuclease-free water 3 x 130 µl HLA DQA1 probes Mix Upstream primer 1, Upstream primer 2, downstream primer, Target probes (FAM for DQA1*02, VIC for DQA1*03 and NED for DQA1*05), Nuclease-free water 3 x 130 µl HLA DQB1 probes Mix Upstream primer, downstream primer, Target probe (FAM for DQB1*02, VIC for DQB1*0302 and NED for IC •-Globin ), Nuclease-free water R4 3 x 35 µl Cloned DNA corresponding to the DQA1*02 allele R5 3 x 35 µl Cloned DNA corresponding to the DQA1*03 allele R6 3 x 35 µl Cloned DNA corresponding to the DQA1*05 allele R7 3 x 35 µl Cloned DNA corresponding to the DQB1*02 allele R8 3 x 35 µl Cloned DNA corresponding to the DQB1*0302 allele R9 1 x 30 µl Negative Control Istruction for use: ST.RT59-ENG.4 MATERIALS AND STRUMENTATION REQUIRED BUT NOT SUPPLIED Disposable latex powder-free gloves or similar material; Bench microcentrifuge (12,000 - 14,000 rpm); Micropipettes and Sterile tips with aerosol filter; Vortex; Plastic materials (microplate and optica adesive cover); Reagents Manual Extraction EX05 – DNA Extraction from Blood, Uretral, Vaginal and Cervical Swab. The kit allows the manual DNA extraction from Human samples. The kit contains reagents enough to perform the DNA extraction for 50 samples. (Clonit srl) Strumentation Real Time PCR • 7500 Fast from Lifetechnologies • StepOne Plus from Lifetechnologies SAMPLES AND STORAGE The Celiac Disease system must be used with extracted DNA from the following biological samples: Blood EDTA. Collected samples must be shipped and stored at +2 - +8°C and used within 3 days from the collected data. Store the sample at -20°C if it is used after 3 days. PRECAUTIONS USE This kit is for in vitro diagnostic (IVD), for professional use only and not for in vivo use. After reconstitution, the amplification master mix must be used in one time (16 reactions). Do not re-frost already used material. At all times follow Good Laboratory Practice (GLP) guidelines. Wear protective clothing such as laboratory coats and disposable gloves while assaying samples. Avoid any contact between hands and eyes or nose during specimens collection and testing. Handle and dispose all used materials into appropriate biohazard waste containers. It should be discarded according to local law. Keep separated the extraction and the reagents preparation. Never pipette solutions by mouth. Avoid the air bubbles during the master mix dispensing. Eliminate them before starting amplification. Wash hands carefully after handling samples and reagents. Do not mix reagents from different lots. It is not infectious and hazardous for the health (see Material Safety data Sheet – MSDS). Do not eat, drink or smoke in the area where specimens and kit reagents are handled. Read carefully the instructions notice before using this test. Do not use beyond the expiration date which appears on the package label. Do not use a test from a damaged protective wrapper. LIMIT OF THE METHOD The extreme sensitivity of gene amplification may cause false positives due to cross-contamination between samples and controls. Therefore, you should: physically separate all the products and reagents used for amplification reactions from those used for other reactions, as well as from post-amplification products; use tips with filters to prevent cross-contamination between samples; use disposable gloves and change them frequently; carefully open test tubes to prevent aerosol formation; - close every test tube before opening another one. The proper functioning of the amplification mix depends on the correct collection, correct transportation, correct storage and correct preparation of a biological sample. As with any diagnostic device, the results obtained with this product must be interpreted taking in consideration all the clinical data and other laboratory tests done on the patient. As with any diagnostic device, with this product there is a residual risk of obtaining invalid, false positives or false negatives results. STORAGE AND STABILITY Store the product Celiac Disease at –20°C. An intact and well stored product has a stability of 12 months from the date of production. Do not use beyond the expiration date which appears on the package label. ANALYTICAL PROCEDURE Human DNA Extraction Manual Extraction EX05 - DNA Extraction from Blood, Uretral, Vaginal and Cervical Swab 1. add 0.2 ml of whole blood from each specimen to the relevant test tube after mixing it 2. if a precipitate has formed in buffer AL, dissolve by incubating at 56°C 3. add 20 µl proteinase K solution and 200 µl buffer AL. Mix immediately by vortexing for 15 seconds 4. incubate at 56°C for 10 minutes. Briefly centrifuge the tube to remove drops from the inside of the lid 5. add 200 µl ethanol 95% to the sample, and mix again by pulse-vortexing for 15 seconds. Briefly centrifuge the tube to remove drops from the inside of the lid 6. carefully apply the mixture from step 5 to the spin column (in a 2 ml collection tube) without wetting the rim, close the cap and centrifuge at 6000 g for 1 minute. Place the spin column in a clean 2 ml collection tube and discard the tube containing the filtrate 7. carefully open the spin column and add 500 µl buffer AW1 without wetting the rim. Close the cap and centrifuge at 6000 g for 1 minute. Place the spin column in a clean 2 ml collection tube and discard the collection tube containing the filtrate 8. carefully open the spin column and add 500 µl buffer AW2 without wetting the rim. Close the cap and centrifuge at full speed for 3 minutes 9. place the spin column in a clean 1.5 ml microcentrifuge tube and discard the collection tube containing the filtrate. Carefully open the spin column and add 50 µl buffer AE. Incubate at room temperature for 1 minute and then centrifuge at 6000 g for 1 minute Samples are now ready for amplification or storage at -20°C. SOFTWARE SETTING: Lifetechnologies 7500 fast/StepOne plus Turn the instrument and the computer on and open the control software. Click on “Advance Setup”: by default the sofware will shows the page “experiment properties”. Write in the “experiment name” the file name, choose the type of instrument (ABI7500 or ABI7500fast), the type of reaction (quantitation standard curve), the type of used reagent (TaqmanReagents) and the reaction time of analysis (Standard ≈ 2 hours to complete a run). Open the page named “page setup” (sheet Define Target and Samples). In the window Define Targets set: Target HLA DQA1*02 probe: HLA DQA1*03 probe: HLA DQA1*05 probe: HLA DQB1*02 probe: HLA DQB1*0302 probe: IC (β-globin) probe: Reporter FAM VIC NED FAM VIC NED Quencer NFQ NFQ NFQ NFQ NFQ NFQ Distribute, in the amplification plate, 20 µl of just reconstituted mix in chosen positions and already setted on the instrument software. Distribute, in the negative conrol position, 5µl of solution taken by the negative control vial. Distribute, in chosen positions for the positive controls, 5µl of DQA1*02 positive control, DQA1*03 positive control, DQA1*05 positive control, DQB1*02 positive control and DQB1*0302 positive control solution. Seal up accurately the plate using an optichal adesive film and verify that there aren’t air bubbles in the mix to avoid the amplification interferences. Transfer the plate in the instrument and push the button “Start Run”. QUALITATIVE ANALYSIS Lifetechnologies 7500 Fast, StepOne Plus. At the end of the PCR run, the software automatically opens the "Analysis" window in the "Amplification plot" sheet on the menu on the left. Select an area of the plate where the controls will be placed: select wells of the plate and set both targets (HLA DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05, DQB1*02, DQB1*0302 and β-globin). Select “Assign target to selected wells” in the blank, the “task Standard (S)” for HLA DQA1 and DQB1 targets and set the controls’concentration. Select the wells corresponding to the positive control, negative control and samples for analysis. Choose an area in the plate where negative control will be placed: select “Assign target to selected wells” in the blank, the “task Negative (N)” for the HLA DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05, DQB1*02, DQB1*0302 and β-globin targets. Select in the "Option" window inside the "Target" pop-up menu the HLA DQA1*03 target. Enter the threshold indicated in the table. S1 S2 S3 S4 S5 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 N N C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 Mix HLA DQA1 Set ROX as passive reference, using it as normalizer of detected fluorescence. Open “Run Method” (sheet Graphic View) and set the thermal cycling as follows: cycles 1 1 35 Select in the "Option" window inside the "Target" pop-up menu the HLA DQA1*02 target. Enter the threshold indicated in the table. Select in the "Option" window inside the "Target" pop-up menu the HLA DQA1*05 target. Enter the threshold indicated in the table. Select in the "Option" window inside the "Target" pop-up menu the HLA DQB1*02 target. Enter the threshold indicated in the table. denaturation 50° C 2 min 95°C 10 min 95° C 15 sec In the window “Reaction volume plate per well” set a volume of 25 µl. After having prepared the plate, and correctly inserted in the instrument, press the button “Start Run”. PREPARATION OF THE REACTIONS: Defrost a tube of Amplification mMix; Defrost one tube of HLA DQA1 probes Mix and one tube of HLA DQB1 probes Mix; Mix carefully by vortex 210µl of Amplification mMix, 126µl di HLA DQA1 probes Mix and 210µl di Amplification mMix with 126µl di HLA DQB1 probes Mix (the mix as produced is enough to prepare 16 reactions of amplification). Parameter Positive control HLA DQB1.02 Positive control HLA DQB1.03.02 If the amplification reaction of each controls produces a Ct > 27 the session can’t be considered valid and so it must be cancelled. Be sure that there isn’t any specific fluorescence increasing for examining target in negative control (FAM). In the amplification reaction of each sample, the Ct values for the internal control (β-globin) specific probe are used for validating the analysis session. Beginning from extraction process until detection step. Be sure that emitted fluorescence from internal control amplification has not a Ct > 27 or undetermined. If the internal control Ct > 27 means that some problems happened in the extraction step or in the amplification step; therefore the sample could be a false negative. Repeat the sample. ANALYSIS OF THE RESULTS The most relevant genetic factor present in HLA region is represented by DQ2 heterodimer; it is coded by HLA DQA1*05 and DQB1*02 genes. Celiac disease affected that are negative for DQ2 show, in the major part of cases, the DQ8 heterodimer, coded by HLA DQA1*03 and DQB1*0302. HLA DQ2 NEGATIVE VIC Threshold 0.1 0.1 NED Threshold 0.1 0.1 The analysis of the results is made selecting from the menu in the left the page “Analysis”. From the page “Amplification Plot” verify the amplification plot for every single sample. Opening the sheet “view well table” in the right side of the software it is possible to verify the data obtained from experiments: Threshold Cycles and emitted fluorescences. Clicking from the menu file and selecting the box export, the window “export properties” will open. Indicate the file name, select the position to save it (Browse) and click on button “Start export”. In this way the software will permit to save a excel file with all the data corresponding to selected experiment. INTERPRETATION OF RESULTS In the Real Time PCR reaction the Ct values of specific probe are used for detect the presence of the Target in analysis. As with any diagnostic device, the results obtained with this product must be interpreted taking in consideration all the clinical data and other laboratory tests done on the patient. The use of positive and negative control in each amplification session allows to verify the correct functioning of the amplifcation mix and the absence of any contamination. The instrument software is able to analyze the fluorescences that are emitted by the specific probe for HLA DQA1*02 (FAM), DQA1*03 (VIC), DQA1*05 (NED) and DQB1*02 (FAM), DQB1*0302 (VIC) and β-globin (NED). Reference Ct ≤ 27 Ct ≤ 27 Be sure that there isn’t any specific fluorescence increasing for examining target in negative control (FAM, VIC and NED). Select in the "Option" window inside the "Target" pop-up menu the IC • -Globin target. Enter the threshold indicated in the table. FAM Threshold 0.2 0.2 Reference Ct ≤ 27 Ct ≤ 27 Ct ≤ 27 Mix HLA DQB1 POSITIVE annealing/extension 60° C 1 min Parameter Positive control HLA DQA1.02 Positive control HLA DQA1.03 Positive control HLA DQA1.05 Select in the "Option" window inside the "Target" pop-up menu the HLA DQB1*0302 target. Enter the threshold indicated in the table. 7500 Fast StepOne Plus Mix HLA DQB1 A proper functioning of the amplification mix can be verified analyzing these parameters: Mix HLA DQA1 Distribute, in chosen position for each sample, 5µl of corresponding sample. Set the samples’ name in the window “Define Samples”. In the same page “plate setup” select the sheet “Assign Target and Samples”. On the screen you will see the microplate draft. Select an area of the plate where samples will be placed: select the wells and set both targets (HLA DQA1, DQB1 and βglobin). Link every well to a sample, through the window “Assign samples to selected wells”. For each sample, select in the blank “Assign targets to selected wells” the “task UnKnown (U)” for the HLA DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05, DQB1*02, DQB1*0302 and βglobin targets. Concerning the haplotype DQB1*0302, are considered as positive only samples with a Ct <31. DQB1*02 X X X X DQA1*05 DQA1*02 X X X X X X X X The main genetic factor is localized in the HLA-DQ region and it’s represented by DQ2 heterodimer coded by HLA-DQA1*05 and DQB1*02 genes. DQB1*02: only beta chain DQ2 DQB1*02 and DQA1*05: DQ2 DQB1*02 and DQA1*02: Only beta chain DQ2 heterodimer DQB1*02, DQA1*05 and DQA1*02: DQ2 heterodimer HLA DQ8 POSITIVE DQA1*03 X NEGATIVE X DQB1*0302 X X In people suffering from celiac disease that are negative for HLA-DQ2, this genetic illness is dued to the presence of DQ8 heterodimer coded by HLA-DQA1*03 and DQB1*0302 genes. PERFORMANCES Clinical Sensitivity: With the aim of this evaluation, clinic sensitivity is considered as the capacity of determinate real positive in whole number of screened positive samples. The analysis is prepared on positive sample for DQ2 and DQ8 and the test is performed following the instruction present in the method, making a comparison between our method and a system with CE mark, already marked. Analyzed samples Obtained Results Clinical Sensitivity HLA-DQ2 29 29 HLA-DQ2/HLA-DQ8 6 6 HLA-DQ8 13 13 100% 100% 100% Diagnostic Specificity: With the aim of this evaluation, diagnostic specificity is considered as the capacity of determinate real negative samples. Diagnostic specificity of the system is valued analyzing genomic human samples tested and confirmed to be negative with another system already marked. Samples Donors’ EDTA blood N 50 Positive 1 Negative 49 Diagnostic specificty results at 98% for samples of DNA extracted by whole blood EDTA Analytical Specificity: Test’s specificity is guaranteed by the use of specific primers for determining HLA DQ. haplotypes. The alignment of the choose regions for specific primers’ hybridization for HLA DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05 and DQB1*02, DQB1*0302 with available sequences present in database, demonstrated their conservation, the absence of significative mutations and the complete specificity for the analyzed target. INTERFERENCES: Verify that in DNA extracted from the sample there aren’t nucleoproteins and haemoglobin, in way of exclude possible inhibition of PCR reactions. The interference due to contaminants can be highlighted through the spectrophotometric analysis and obtained data report at 260 nm (maximum absorbtion of Nucleic Acids) and 280 nm (maximum absorbtion of Proteins). A pure DNA might have a rate of approximately 1.8. QUALITY CONTROL It is therefore recommended to insert as quality control of every extraction session, amplification and detection of a negative sample and of a positive sample which have already tested before or referential material with known concentration. BIBLIOGRAPHY TROUBLESHOOTING Petronzelli F. et al. “Genetic contribution of the HLA region to the familial clustering of celiac disease”. Ann. Hum. Genet. 1997; 61: 307-17 Presence, in the negative control, of the fluorescence specific for the target: Bevan S., et al. “Contribution of the MHC region to the familial risk of celiac disease”. J. Med Genet 1999; 36: 68790 Possible causes Contamination during the dispensing of the positive sample or of the positive control De Marchi et al. “Two HLA-DR alleles are associated with celiac disease”. Tissue Antigens 1979; 14: 309-16 Karell K et al. “HLA types in celiac disease patients not carrying DQ2 heterodimer”. Hum Immunol 2003; 64: 469-77 M. Valisi, A. Colombo, A. Donnangelo, A. Marzorati, D. Stangalini , A. Stangalini, C. Roccio, D. Russo.”Multiplex Real Time PCR evaluation of celiac disease predisposition (HLA-DQ2 AND HLA-DQ8) in 102 cases and relative correlation with HLA-DRB1 HAPLOTYPE investigated by reverse Dot-Blot Hybridication”. SIBIOC 2012 congress. http://www.clonit.it/en-GB/research-and-development/scientificreferences-and-medical-publication/ Contamination of the amplification mixes Badly sealed microplate Error during the setup of the plate on the instrument In vitro diagnostic device Read the instruction’s manual Solutions • Use only micropipettes and Sterile tips with aerosol filter • Always change tip between a sample and another • Clean surfaces and instruments with aqueous detergents, wash lab coats, replace test tubes and tips in use • During analytical stage, dispense the positive control at the end of the analytical procedure • During analytical stage, dispense the negative control at the beginning of the analytical procedure • Don’t dispense the amplification mix with the same pipettes used in the extraction or detection area • Use only micropipettes and Sterile tips with aerosol filter • Clean surfaces and instruments with aqueous detergents, wash lab coats, replace test tubes and tips in use • Seal the amplification mix and return it at 20°C before to open the other sample tubes • Seal very carefully the microplate • • Contamination of the area dedicated to the amplification stage Check the correct correspondence between setting on the instrument and the real positions on the microplate (for samples, negative controls and standard) Clean surfaces and instruments with aqueous detergents that can degrade DNA, wash lab coats, replace test tubes and tips in use Range of temperature Use within (dd/mm/yyyy: yearmonth) Lot (xxxx) Code Manufacturer Contains sufficient for <n> tests EDMA code: 1601049000 CND: W0105040205 Failure or incorrect amplification of the positive control: Possible causes Possible mistakes in the dispensation of the positive control Positive Control Degradation Wrong heat protocol The reaction mix is mantained at room temperature for too long Solutions • Dispense carefully the positive control • Check the calibration of micropipettes used • Verify that the amount of positive control dispensed corresponds to the quantity indicated in the Analytical Procedure (5•l) • Test the mixture through a new batch of positive control • Check the thermal cycler setting • Keep the amplification mix on ice during the use and store it at -20 ° C immediately after finishing the preparation of test samples Failure or incorrect amplification of internal control in tested samples: Possible causes Presence of possibile interferences Extracted DNA in insufficient quantity Solutions • Carefully repeat sample extraction stage • • Carefully repeat sample extraction stage Accurately samples storage CLONIT S.r.l. Headquarter: Via Varese 20 – 20121 Milano Production Site: Via B. Quaranta 57 - 20139 Milano Tel. + 39. (0)2.56814413 fax. +39. (0)2.56814515 www.clonit.it - info@clonit.it for in vitro diagnostic use ST. RT59-ENG.4 Printed: 07th July 2014 HLA-DQ2 / HLA-DQ8 Celiac Disease REF: RT-59 Genotipizzazione degli alleli HLA DQ e DR INTRODUZIONE E DESTINAZIONE D’USO Il prodotto Celiac Disease è un saggio che consente l’identificazione degli aplotipi HLA DQ2 e DQ8 mediante metodica Real Time PCR; nello specifico, permette la genotipizzazione degli alleli HLA DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05 e DQB1*02, DQB1*0302 dopo estrazione di DNA genomico da campioni biologici. La procedura prevede il rilevamento del DNA target di interesse mediante una reazione di amplificazione genomica in micropiastra. L’analisi dei risultati viene effettuata tramite uno strumento di Real Time PCR, composto da un thermal cycler provvisto di un sistema di rilevamento della fluorescenza. COMPOSIZIONE Il sistema contiene reagenti sufficienti per l’esecuzione di 48 test. Quantità Descrizione 3 x 420 µl Amplification mMix dNTPs, Tris-HCl, KCl, MgCl2, Taq Polymerase, Nuclease-free water 3 x 130 µl HLA DQA1 probes Mix Upstream primer 1, Upstream primer 2, downstream primer, Target probes (FAM for DQA1*02, VIC for DQA1*03 and NED for DQA1*05), Nuclease-free water R3 3 x 130 µl HLA DQB1 probes Mix Upstream primer, downstream primer, Target probe (FAM for DQB1*02, VIC for DQB1*0302 and NED for IC •-Globin ), Nuclease-free water R4 3 x 35 µl Controllo positivo allele DQA1*02 R5 3 x 35 µl Controllo positivo allele DQA1*03 R6 3 x 35 µl Controllo positivo allele DQA1*05 R7 3 x 35 µl Controllo positivo allele DQB1*02 R1 R2 R8 3 x 35 µl Controllo positivo allele DQB1*0302 R9 1 x 30 µl Controllo negativo Istruzioni per l’uso: ST.RT59-ITA.3 MATERIALE E STRUMENTAZIONE NECESSARIA MA NON FORNITA Gli utilizzatori devono seguire le norme “Good Laboratory Practice” (GLP). Indossare abiti protettivi come camice di laboratorio e guanti monouso durante la manipolazione di campioni. Evitare il contatto con tra le mani e occhi o naso durante la raccolta ed uso dei campioni. La raccolta di tutti i materiali utilizzati deve essere fatto in appositi contenitori e lo smaltimento svolto in accordo con le leggi locali. Disporre aree separate per l’estrazione e l’allestimento delle reazioni. Non pipettare a bocca alcuna soluzione. Evitare la formazione di aria nel depositare la miscela all’interno delle provette. Eliminare ogni bolla prima di procedere con l’amplificazione. Lavare bene le mani dopo aver maneggiato i campioni ed i reagenti. Non scambiare reagenti provenienti da lotti diversi. Non è infettivo o pericoloso per la salute (vedi schede di sicurezza). Non mangiare, bere o fumare dove i campioni ed i kit vengono utilizzati. Leggere attentamente le istruzioni d’uso prima di utilizzare il test. Non utilizzare oltre la data di scadenza riportata sulla scatola. Non utilizzare il kit se l’involucro è danneggiato. LIMITI DEL METODO ED AVVERTENZE L’elevata sensibilità della metodica di amplificazione genica rende possibile l’insorgenza di falsi positivi, dovuti a contaminazioni crociate fra campioni e controlli. E’ pertanto necessario attenersi alle seguenti indicazioni: • separare fisicamente tutti i materiali e reagenti dedicati alla reazione di amplificazione da quelli utilizzati per altre metodiche e dai prodotti già amplificati • utilizzare puntali con filtro per evitare contaminazioni crociate fra campioni • cambiare frequentemente i guanti • aprire le provette con cautela per prevenire la formazione di aerosol • chiudere ogni provetta prima di aprirne un’altra L’ottimale funzionamento della miscela di amplificazione dipende dalla corretta raccolta, dal corretto trasporto, dal corretto stoccaggio nonché da una corretta preparazione del campione biologico prelevato. I risultati ottenuti utilizzando il prodotto devono essere interpretati considerando tutti i dati clinici e laboratoristici legati al paziente. Come per qualunque altro dispositivo diagnostico, esiste un rischio residuo di ottenere risultati non validi che non può essere eliminato o ridotto ulteriormente. CONSERVAZIONE E STABILITÀ Guanti senza polvere monouso in lattice o simili; Microcentrifuga da banco; Micropipette e puntali sterili con filtro incorporato per la prevenzione di aerosol; Vortex; Materiale plastico monouso sterile (Micropiastra e pellicole ottiche adesive); Conservare il prodotto Celiac Disease a –20°C. Il prodotto integro e correttamente conservato ha una stabilità di 12 mesi dalla data di produzione. Non utilizzare oltre la data di scadenza riportata sulla scatola. Reagenti EX05 - Estrazione di DNA da sangue o tampone uretrale, vaginale e cervicale Il Sistema consente l’estrazione del DNA dai campioni in esame. Il kit contiene reagenti utili per 50 estrazioni. Estrazione Manuale EX05 - Estrazione di DNA da sangue o tampone uretrale, vaginale e cervicale. Strumenti Real Time PCR • 7500 Fast from Lifetechnologies • StepOne Plus from Lifetechnologies CAMPIONI E CONSERVAZIONE Il prodotto Celiac Disease è progettato per essere utilizzato con DNA estratto dai seguenti campioni biologici: Sangue intero EDTA. I campioni raccolti devono essere trasportati e conservati a +2-+8°C ed utilizzati entro 3 giorni dalla data del prelievo. Conservare il campione a -20°C se utilizzato dopo 3 giorni. PRECAUZIONI D’USO Il kit è per un uso diagnostico in vitro (IVD), per uso professionale e non per uso in vivo. Una volta ricostituita, la miscela di amplificazione deve essere utilizzata in un'unica sessione (16 reazioni). Non ricongelare il materiale già utilizzato. PROCEDURA ANALITICA Estrazione di DNA genomico 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. porre 200 µl di sangue in una provetta da 2 ml se nel buffer AL è presente un precipitato, scaldarlo a 56°C per scioglierlo aggiungere 20 µl di soluzione di proteinasi K e 200 µl di buffer AL: miscelare vortexando per 15 secondi incubare a 56°C per 10 minuti e centrifugare brevemente per togliere eventuali gocce dal tappo della provetta aggiungere 200 µl di etanolo 95%, vortexare per 15 secondi e ricentrifugare brevemente predisporre le colonnine, inserite nei tubi di raccolta, in un numero pari a quello dei campioni trattati aggiungere la miscela ottenuta al punto 6 all'interno delle colonnine e centrifugare a 6.000 g per 1 minuto. Porre le colonnine in un tubo di raccolta pulito ed eliminare quello contenente il filtrato aggiungere 500 µl di buffer AW1 in ogni colonnina e centrifugare a 6.000 g per 1 minuto. Porre le colonnine in un tubo di raccolta pulito ed eliminare quello contenente il filtrato aggiungere 500 µl di buffer AW2 in ogni colonnina e centrifugare a 14.000 g per 3 minuti. Porre le colonnine in una provetta da 1,5 ml ed eliminare quella contenente il filtrato aggiungere 50 µl di buffer AE in ogni colonnina, incubare a temperatura ambiente per 1 minuto e centrifugare a 6.000 g per 1 minuto: nell'eluato è presente il DNA Aprire la pagina “Run Method” (sheet Graphic View) ed impostare il ciclo termico corretto: Il campione così preparato può essere utilizzato subito oppure conservato a -20°C. Nella finestra “Reaction volume plate per well” impostare il volume di 25 µl. 10. IMPOSTAZIONI DEL SOFTWARE Lifetechnologies 7500 fast/StepOne plus Accendere lo strumento, il computer ed avviare il software di controllo. Dalla schermata principale del software cliccare sul bottone “Advanced Setup”: di default il software vi mostra la pagina “experiment properties”. Digitare nella finestra “experiment name” il nome con il quale verrà salvato l’esperimento. Scegliere il tipo di strumento che si utilizza (ABI7500 o ABI7500fast – StepOne o StepOne plus), scegliere il tipo di esperimento (quantitation standard curve), il tipo di reagenti utilizzati (Taqmanreagents) ed il tempo di reazione (Standard ≈ 2 hours to complete a run). Aprire la pagina “page setup” (sheet Define Target and Samples). Nella finestra “Define Targets” impostare: Target HLA DQA1*02 probe: HLA DQA1*03 probe: HLA DQA1*05 probe: HLA DQB1*02 probe: HLA DQB1*0302 probe: IC (β-globin) probe: Reporter FAM VIC NED FAM VIC NED Quencer NFQ NFQ NFQ NFQ NFQ NFQ Nella finestra “Define Samples” impostare il nome dei campioni in analisi. Sempre nella pagina “plate setup” selezionare lo sheet “Assign Target and Samples”: comparirà nella vostra schermata la piastra schematizzata. Scegliere una zona della piastra dove verranno posizionati i controlli HLA DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05: selezionare i pozzetti della piastra ed impostare tutti i target in analisi (HLA DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05). Selezionare nello spazio “Assign target to selected wells” il “task Standard (S)” Scegliere una zona della piastra dove verranno posizionati i controlli DQB1*02, DQB1*0302 selezionare i pozzetti della piastra ed impostare tutti i target in analisi (DQB1*02, DQB1*0302). Selezionare nello spazio “Assign target to selected wells” il “task Standard (S)” Scegliere una zona della piastra dove verrà posizionato il controllo negativo: selezionare nello spazio “Assign target to selected wells” il “task Negative (N)” per i target HLA DQA1, DQB1 e •-globina. Scegliere una zona della piastra dove verranno posizionati i campioni in analisi per i target HLA DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05: selezionare i pozzetti della piastra ed impostare tutti i target (DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05). Associare,ad ogni pozzetto un campione in analisi mediante la finestra “Assign samples to selected wells”. Selezionare per ciascun campione nell’apposito spazio “Assign targets to selected wells” il “task UnKnown (U)” Scegliere una zona della piastra dove verranno posizionati i campioni in analisi per i target HLA DQB1*02, DQB1*0302 e •globina: selezionare i pozzetti della piastra ed impostare tutti i target (HLA DQB1*02, DQB1*0302 e •-globina). Associare,ad ogni pozzetto un campione in analisi mediante la finestra “Assign samples to selected wells”. Selezionare per ciascun campione nell’apposito spazio “Assign targets to selected wells” il “task UnKnown (U)” S1 S2 S3 S4 S5 N N C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 Mix HLA DQA1 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 cycles 1 1 35 denaturation 50° C 2 min 95°C 10 min 95° C 15 sec annealing/extension 60° C 1 min Non appena preparata la piastra, e dopo averla correttamente inserita nello strumento, premere il pulsante “Start Run”. ALLESTIMENTO DELLE REAZIONI: Scongelare una provetta di Amplification mMix; Scongelare una provetta di HLA DQA1 probes Mix e una di HLA DQB1 probes Mix. Miscelare accuratamente mediante vortex 210 µl di Amplification mMix, 126 µl di HLA DQA1 probes Mix; Miscelare accuratamente mediante vortex 210 µl di Amplification mMix con 126 µl di HLA DQB1 probes Mix; Le miscela così prodotte sono sufficienti per l’esecuzione di 16 reazioni di amplificazione. Dispensare, nella piastra di amplificazione, 20 µl della miscela appena ricostituita nelle posizioni prescelte e gia’ predisposte sul software dello strumento. Dispensare, nella posizione del controllo negativo, 5 µl di soluzione prelevata dalla vial controllo negativo. Dispensare, nelle posizioni predefinite per ciascun campione, 5 µl del campione corrispondente. Dispensare, nelle posizioni predisposte per i controlli positivi, 5 µl di soluzione DQA1*02 positive control, DQA1*03 positive control, DQA1*05 positive control, DQB1*02 positive control e DQB1*0302 positive control Sigillare accuratamente la piastra mediante l’utilizzo di optichal adesive film e verificare che, nella miscela, non vi siano bolle d’aria che possano interferire con l’amplificazione. Trasferire la piastra nello strumento e premere il pulsante “Start Run”. ANALISI QUALITATIVA Lifetechnologies 7500 Fast, StepOne Plus. Al termine della corsa di PCR il software apre automaticamente la finestra “Analysis” nella sezione “Amplification plot” posta nel Menu a sinistra. Selezionare dalla piastra i pozzetti corrispondenti ai controlli positivi, al controllo negativo ed ai campioni in analisi. Selezionare nella finestra “Option” il Menu a tendina “Target” e impostare HLA DQA1*02. Inserire il Threshold indicato in tabella. Selezionare nella finestra “Option” il Menu a tendina “Target” e impostare HLA DQA1*03. Inserire il Threshold indicato in tabella. Selezionare nella finestra “Option” il Menu a tendina “Target” e impostare HLA DQA1*05. Inserire il Threshold indicato in tabella. Selezionare nella finestra “Option” il Menu a tendina “Target” e impostare HLA DQB1*02. Inserire il Threshold indicato in tabella. Selezionare nella finestra “Option” il Menu a tendina “Target” e impostare HLA DQB1*0302. Inserire il Threshold indicato in tabella. Selezionare nella finestra “Option” il Menu a tendina “Target” e impostare IC Control. Inserire il Threshold indicato in tabella. 7500 Fast StepOne Plus Mix HLA DQB1 Impostare come passive reference, utilizzato normalizzatore della fluorescenza rilevata, il ROX. come FAM Threshold 0.2 0.2 VIC Threshold 0.1 0.1 NED Threshold 0.1 0.1 Selezionando lo sheet “view well table” è possibile visualizzare al posto della rappresentazione della piastra in analisi, la tabella con i risultati ottenuti. Cliccando sul Menu “file” e successivamento su “export” è inoltre possibile esportare i dati su file exel. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Nelle reazioni di amplificazione di ciascun campione, i valori di Ct delle sonda specifiche sono utilizzate per rilevare la presenza dei Target in analisi. I risultati ottenuti con questo saggio devono essere interpretati considerando tutti i dati clinici e gli altri esami di laboratorio relativi al paziente. L’utilizzo del controllo positivo e negativo all’interno di ogni sessione di amplificazione consente di verificare il corretto funzionamento della miscela e l’assenza di possibili contaminazioni. Il software dello strumento è in grado di analizzare le fluorescenze emesse dalle sonde specifiche per HLA DQA1*02 (FAM), DQA1*03 (VIC), DQA1*05 (NED) e DQB1*02 (FAM), DQB1*0302 (VIC) e IC •-Globina (NED). Una corretta analisi dei risultati necessita di un corretto setting della strumentazione. A tale scopo impostare: Per quanto riguarda l’aplotipo DQB1*0302 sono da considerarsi positivi solamente i campioni che presentano un Ct < 31. Un corretto funzionamento della miscela di amplificazione può essere verificato analizzando i seguenti parametri : Mix HLA DQA1 Parameter Positive control HLA DQA1.02 Positive control HLA DQA1.03 Positive control HLA DQA1.05 Reference Ct ≤ 27 Ct ≤ 27 Ct ≤ 27 Mix HLA DQB1 Parameter Positive control HLA DQB1.02 Positive control HLA DQB1.03.02 Reference Ct ≤ 27 Ct ≤ 27 N.B.: In tutti i campioni in esame, il target IC •-Globina dovrà presentare un Ct ≤ 27, per confermare all’utente una corretta seduta di estrazione. Assicurarsi che non vi sia nel controllo negativo alcun aumento della fluorescenza specifica per i target in esame (FAM, VIC e NED). Nelle reazioni di amplificazione di ciascun campione, i valori di Ct della sonda specifica per il controllo interno (β-globina) vengono utilizzati per convalidare la sessione d’analisi a partire dal processo di estrazione sino alla fase di detection. Assicurarsi che la fluorescenza emessa dall’amplificazione del controllo interno non presenti un Ct > 27 o undetermined. Se un campione presenta Target undetermined e Ct del controllo interno >27 significa che si sono verificati problemi nella fase di estrazione o nella fase di amplificazione e quindi il campione potrebbe essere un falso negativo. Ripetere il campione. ANALISI DEI RISULTATI La tipizzazione HLA nella Celiachia è un test genetico di suscettibilità che valuta la maggiore o minore predisposizione di un individuo a sviluppare la malattia. L’analisi dei geni HLA di suscettibilità ha soprattutto valore predittivo negativo, in quanto l’assenza di alleli a rischio rende altamente improbabile lo sviluppo della malattia. HLA DQ2 POSITIVE NEGATIVE DQB1*02 X X X X DQA1*05 DQA1*02 X X X X X X X X Il principale fattore genetico si trova nella regione HLA-DQ ed è rappresentato dall’eterodimero DQ2 codificato dai geni HLADQA1*05 e DQB1*02. DQB1*02: Solo catena beta eterodimero DQ2 DQB1*02 e DQA1*05: Eterodimero DQ2 DQB1*02 e DQA1*02: Solo catena beta eterodimero DQ2 DQB1*02, DQA1*05 e DQA1*02: Eterodimero DQ2 Gli affetti da celiachia negativi per HLA-DQ2 presentano per la maggior parte l’eterodimero DQ8 codificato dai geni HLADQA1*03 e DQB1*0302. HLA DQ8 POSITIVE DQA1*03 X NEGATIVE X DQB1*0302 X X CARATTERISTICHE FUNZIONALI Sensibilità clinica: Ai fini della presente valutazione, viene considerata sensibilità clinica la capacità di determinare veri positivi sulla totalità di campioni positivi screenati. L’analisi è stata effettuata su campioni positivi per DQ2 e DQ8 ed il test è stato eseguito seguendo le indicazioni riportate nella metodica confrontando la metodica con un sistema marcato CE già presente in commercio. Campioni Analizzati Risultati ottenuti HLA-DQ2 29 29 HLA-DQ2/HLA-DQ8 6 6 HLA-DQ8 13 13 Sensibilità Clinica 100% 100% 100% Specificità Diagnostica: Ai fini della presente valutazione viene considerata specificità diagnostica la capacità del metodo di determinare campioni veri negativi. La specificità diagnostica del sistema è stata valutata analizzando campioni genomici umani testati e confermati negativi con un altro sistema presente in commercio. Samples Donors’ EDTA blood N 50 Positive 1 Negative 49 La specificità diagnostica risulta essere al 98% per i campioni di DNA estratto da sangue intero con EDTA. Specificità Analitica: La specificità del test è garantita dall’utilizzo di primers specifici per la determinazione degli aplotipi HLA DQ. L’esame di allineamento delle regioni scelte per l’ibridazione dei primers specifici per HLA DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05 e DQB1*02, DQB1*0302 e •-Globina, con le sequenze disponibili in banca dati ha dimostrato la loro conservazione, l’assenza di mutazioni significative e la completa specificità per i target analizzati. Campioni riconosciuti come positivi per un determinato aplotipo devono essere riconosciuti come tali dal sistema di amplificazione descritto. INTERFERENZE Verificare che nel DNA estratto dal campione di partenza non vi siano presenti mucoproteine ed emoglobina in modo da escludere eventuali inibizioni nella reazione di PCR. L'interferenza dovuta a contaminanti può essere evidenziata mediante l’analisi spettrofotometrica e rapporto dei dati ottenuti a 260 nm (Assorbimento massimo Acidi Nucleici) e 280 nm (Assorbimento massimo Proteine). Un DNA puro dovrebbe avere un rapporto di circa 1.8. CONTROLLO QUALITA’ Si consiglia inoltre di inserire come controllo di qualità interno di ciascuna sessione di estrazione, amplificazione e rilevamento un campione negativo ed un campione positivo già testati in precedenza o materiale di riferimento a titolo noto. BIBLIOGRAFIA TROUBLESHOOTING Petronzelli F. et al. “Genetic contribution of the HLA region to the familial clustering of celiac disease”. Ann. Hum. Genet. 1997; 61: 307-17 Comparsa, nel controllo negativo, della fluorescenza specifica per il Target in esame: Bevan S., et al. “Contribution of the MHC region to the familial risk of celiac disease”. J. Med Genet 1999; 36: 68790 De Marchi et al. “Two HLA-DR alleles are associated with celiac disease”. Tissue Antigens 1979; 14: 309-16 Possibili Errori Possibile contaminazione durante la dispensazione di un campione positivo o del controllo positivo Karell K et al. “HLA types in celiac disease patients not carrying DQ2 heterodimer”. Hum Immunol 2003; 64: 469-77 M. Valisi, A. Colombo, A. Donnangelo, A. Marzorati, D. Stangalini , A. Stangalini, C. Roccio, D. Russo.”Multiplex Real Time PCR evaluation of celiac disease predisposition (HLA-DQ2 AND HLA-DQ8) in 102 cases and relative correlation with HLA-DRB1 HAPLOTYPE investigated by reverse Dot-Blot Hybridication”. SIBIOC 2012 congress. http://www.clonit.it/en-GB/research-and-development/scientificreferences-and-medical-publication/ Contaminazione della Miscela Amplificazione di Micropiastra sigillata male Errore durante l’impostazione della piastra sullo strumento Contaminazione dell’area dedicata all’allestimento delle reazioni di Amplificazione Possibili Rimedi • Utilizzare micropipette e puntali sterili con filtro incorporato per la prevenzione di aerosol • Cambiare sempre puntale tra un campione e l’altro • Pulire attentamente le superfici e gli strumenti in caso di accidentale dispersione di DNA da provette in esame • Nella fase di procedura analitica dispensare il controllo positivo per ultimo • Nella fase di procedura analitica dispensare il controllo negativo per primo • Gestire la miscela di amplificazione con micro pipette differenti da quelle utilizzate nella fase di estrazione o detection • Utilizzare micropipette e puntali sterili con filtro incorporato per la prevenzione di aerosol • Pulire attentamente le superfici e gli strumenti in caso di accidentale dispersione di DNA da provette in esame • Chiudere la miscela di amplificazione e riporla a -20°C prima di aprire le provette potenzialmente inquinanti • Sigillare con molta attenzione la micropiastra • Controllare che non vi siano differenze di posizione (per i campioni, i controlli negativi e standard) tra la micropiastra e quanto impostato sullo strumento. • Pulire attentamente le superfici e gli strumenti con appositi detergenti in grado di degradare il DNA presente Dispositivo In vitro diagnostico Consultare le istruzioni per l’uso Intervallo di temperatura Utilizzare entro (aaaa/mm) Lotto (xxxx) Codice prodotto Fabbricante Contenuto sufficiente per "n" saggi EDMA code: 1601049000 CND: W0105040205 Mancata o non corretta amplificazione del controllo positivo: Possibili Errori Possibile errore durante la dispensazione del controllo positivo Degradazione del controllo positivo Protocollo termico errato Miscela di reazione mantenuta a T° ambiente troppo a lungo Errore durante la dispensazione del prodotto di amplificazione nella fase di detection Possibili Rimedi • Dispensare attentamente il controllo positivo • Verificare la calibrazione delle micropipette utilizzate • Verificare che la quantità di controllo positivo utilizzato corrisponda a quanto descritto in metodica nella sezione Procedura Analitica (3µl) • Verificare il funzionamento della miscela mediante analisi del Ct del controllo interno • Verificare le impostazione del Thermal Cycler • Mantenere la miscela di amplificazione in ghiaccio durante l’uso e riporla a -20°C immediatamente dopo aver terminato la predisposizione dei campioni da analizzare • Prestare attenzione durante la fase di caricamento degli amplificati sul gel Mancata o non corretta amplificazione del controllo interno nei campioni in esame: Possibili Errori Presenza possibili interferenti Quantitativo di DNA estratto non sufficiente Possibili Rimedi • Ripetere attentamente la fase di estrazione del campione • Ripetere attentamente la fase di estrazione del campione • Conservare correttamente i campioni CLONIT S.r.l. Headquarter: Via Varese 20 – 20121 Milano Production Site: Via B. Quaranta 57 - 20139 Milano Tel. + 39. (0)2.56814413 fax. +39. (0)2.56814515 www.clonit.it - info@clonit.it for in vitro diagnostic use ST. RT59-ITA.3 Stampata il 07 luglio 2014
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