Sviluppo di una metodica Sybr-Green real time

Sviluppo di una metodica Sybr-Green real time
PCR per l’identificazione di Mycoplasma agalactiae.
Puleio Roberto, Macaluso Giusi ,Ciprì Valentina, Prudente Chiara, Tamburello Anna, Loria Guido Ruggero.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia.
SUMMARY
The objective of this study was to validate a Sybr-green PCR protocol for Mycoplasma Agalactiae.
Moreover, we analyzed PCR generated amplicons by melting curve to verify method specificity and
sensibility. The sybr-green protocol resulted as sensitive as conventional culture for the detection of
Mycoplasma Agalactiae. The development of a real-time Sybr-green PCR offers advantages in decrease
of time to detection, cost and complexity.
Introduzione.
Mycoplasma Agalactiae è l’agente eziologico dell’Agalassia contagiosa(AC), una patologia dei piccoli
ruminanti che provoca danni ingenti nelle aree in cui viene praticato l’allevamento ovi-caprino. La malattia è endemica nelle
regioni del bacino del Mediterraneo (Bergonier et al., 1997), in Africa, in Asia e negli Stati Uniti. In Sicilia, l’AC è responsabile di
oltre il 30% delle mastiti delle pecore e delle capre e, al momento rappresenta uno dei problemi più seri in termini di economia
zootecnica. La presenza di anticorpi non è identificabile attraverso esami sierologici (ELISA) prima dei 25-30 giorni e
l’escrezione dell’antigene soltanto dopo il 9° giorno dalla prima infezione(Buonavoglia et all.1998). Più recentemente la
polymerase chain reaction (PCR) è entrata nell'uso comune per la sua capacità di aumentare la rapidità di risposta, la sensibilità
e la specificità della diagnosi (Tola et al., 1997; Mc Auliffe et al., 2003).
Obiettivo di questo lavoro è stato mettere a punto una metodica PCR real time mediante chimica fluorescente sybr-green,
determinando la temperatura di annealing specifica per il primer-set e valutando specificità e LOD del saggio.
Materiali e metodi. I campionamenti sono stati eseguiti nel corso della normale attività del laboratorio. Sono stati selezionati 10 campioni positivi all’esame colturale e alla PCR classica per Mycoplasma Agalactiae. Le prove
sono state eseguite mediante il sistema per real time CFX96™, (Biorad). Dal brodo-micoplasma di ciascun campione è stato estratto e purificato il DNA, utilizzando il kit DNA purification (Stratagene™) seguendo la procedura
indicata:100µl di brodo-micoplasma, sono stati trattati termicamente (95°C per 5 minuti) e dopo breve centrifugazione, è stata aggiunta la soluzione “DNA binding”, Etanolo al 70% e tampone di eluizione su colonnina. Il DNA estratto è
stato quindi sottoposto a dosaggio spettrofotometrico (NanoDrop2000c Thermoscientific) per valutarne la concentrazione e la purezza tramite il rapporto OD260/OD280. La concentrazione variava tra 3,64 e 4,98 ng/µl mentre il rapporto
260/280 tra 1.52 e 1.80, confermando il buon esito della fase di estrazione e purificazione. Per la messa a punto del saggio in PCR real time si è proceduto innanzi tutto con la determinazione della temperatura di annealing (Ta) ottimale
per il primer-set utilizzato. La Ta è stata determinata testando contemporaneamente due campioni positivi con gradiente di 8 temperature (da 52ºC a 60°C), centrato sulla temperatura melting (Tm) stimata dei primers. Per il calcolo del
limite di rilevabilità(LOD) sono state effettuate 8 diluizioni seriali in base 10 del DNA precedentemente estratto da una brodocoltura a concentrazione nota (6 x 108UFC). Per la verifica della specificità è stato testato il DNA estratto da un
ceppo di riferimento di Mycoplasma bovis, geneticamente affine a Mycoplasma Agalactiae. Ad ogni esperimento sono stati inclusi un controllo positivo di Mycoplasma Agalactiae scelto tra i ceppi in collezione presso il laboratorio e un
controllo negativo preparato con acqua sterile (no template control). Ciascuna campione è stato analizzato in triplicato.
Protocollo di amplificazione:
Il seguente protocollo amplifica un frammento di 117 bp della sequenza del gene che codifica per la proteina di membrana di 81-kDa(mp81) di M. Agalactiae. .Per la preparazione della Mix di reazione (volume finale di 20 ul) sono stati
di Mycoplasma primer forward (Ma-For)(5’-AAACTTTGAAGATAATGACAAA-3’); 1,2 μl Mycoplasma primer reverse (MaRev)
utilizzati i seguenti reagenti: 10 μl di Sso Advanced™ Sybr-green Supermix, Biorad; 1,2 μl
(5’TGGAATTATGAATGAACCATT-3’) e 3 μl di templato. I primers utilizzati sono stati tratti dal lavoro di Lorusso et al. (2007). Il profilo termico applicato è stato il seguente: denaturazione iniziale a 98°C per 2 minuti, quindi 35 cicli di
denaturazione a 98°C per 5 secondi, annealing/extension a 58°C per 30 secondi (protocollo fast). Dopo la fase di amplificazione è stata impostata l’analisi della curva di dissociazione mediante incremento di temperatura (da 65°C a
95°C con incrementi di 0.5°C/5 sec) al fine di valutare la specifica Tm di Mycoplasma Agalactiae e discriminare eventuali prodotti aspecifici/dimeri di primers. Durante questo incremento termico viene infatti monitorata l’intensità del
segnale fluorescente dell’amplificato, finché ad una determinata e specifica temperatura, detta appunto Tm, il dsDNA si denatura a ssDNA ovvero “dissocia” a singolo filamento, causando il distacco del sybr-green e l’immediato
decremento della fluorescenza, osservabile attraverso il picco di Tm nel grafico.
Fig. 1 Ottimizzazione della temperatura di annealing(la freccia indica la curva di amplificazione a 58°C cn il più basso cT).
Fig. 3 Curva di dissociazione
Fig. 2 Curve per la determinazione del LOD
Tab. 1 Report prova LOD
RISULTATI I dieci campioni testati, ripetuti in triplicato, sono tutti risultati positivi alla prova di PCR real time in sybr-green. I valori del ciclo soglia (cT) sono compresi tra 15.16 e 29.46 e le curve di
amplificazione sono risultate di forma sigmoidale. Queste risultano inoltre riproducibili nei replicati tecnici. All’interno dell’intervallo di Ta testato con gradiente, soltanto le T comprese tra 56 °C e 60 °C generano
buona amplificazione, ma all’interno di questo range solo la Ta di 58°C ha una resa ottimale: basso valore di cT e morfologia sigmoidale della curva. Il limite di rilevabilità (LOD) è stato ricavato determinando la
diluizione più bassa di DNA estratto da brodocoltura in cui almeno due dei triplicati sono risultati positivi. Nel nostro saggio questo valore è corrispondente alla settima diluizione, equivalente quindi a 100 UFC/ml.
Oltre questa diluizione il sistema non ha rilevato fluorescenza per cui al di sotto di tale titolo il campione ignoto viene considerato negativo. Quanto alla specificità, i controlli positivi e negativi testati hanno
confermato i risultati attesi. Il ceppo di riferimento di M.Agalactiae ha un’amplificazione ottimale in termini di cT e morfologia della curva. Il DNA di M.bovis non ha generato segnale fluorescente all’interno del
saggio. L’analisi della curva di dissociazione dell’amplificato ha permesso di stabilire a 74,5°C la Tm specifica di M.Agalactiae ed escludere la presenza di eventuali fluorescenze aspecifiche nelle prove eseguite.
DISCUSSIONE
Il protocollo PCR in sybr-green ha dato risultati sovrapponibili a quelli precedentemente ottenuti con il metodo colturale e con PCR classica. Il Sybr-Green si lega al dsDNA e genera un
segnale fluorescente che aumenta proporzionalmente man mano che i prodotti di pcr aumentano durante i cicli. I vantaggi nell’uso della chimica Sybr-green sono la facilità d’ uso, l’elevata
sensibilità e il minor costo. Gli svantaggi sono relativi al fatto che il Sybr-Green si può legare a qualsiasi dsDNA presente nella reazione, compresi i dimeri di primers e i prodotti aspecifici,
problema che può essere evidenziato grazie all’analisi della curva di dissociazione. Ulteriori aspetti positivi della PCR in sybr-green sono rappresentati da un minor rischio di errori tecnici e di
contaminazione rispetto a una PCR classica. Inoltre i tempi necessari per l’esecuzione e la lettura dei risultati attraverso una PCR real time(3 ore) sono estremamente ridotti sia rispetto
all’esame colturale(una settimana) che alla PCR classica(6-8 ore). La tecnica in sybr-green permette di unire i vantaggi della PCR convenzionale con quelli della real time; infatti il protocollo
viene svolto in un sistema chiuso; utilizza pochi reagenti (primers e sybr-green); permette la quantificazione del DNA amplificato e la curva di dissociazione consente di distinguere diversi
ampliconi che possono essere ritenuti specifici a seconda della temperatura di melting. Infine la maggior versatilità del metodo in sybr-green permetterebbe di sviluppare PCR multiplex per
indagare la contemporanea presenza di diversi mycoplasmi, come ad esempio la presenza sia di Mycoplasma Agalactiae che Mycoplasma mycoides cluster.
References
Bergonier D, Berthelot X, Poumarat F. Contagious agalactia of small ruminants: current knowledge concerning epide miology, diagnosis and control. Rev Sci Tech. 1997 Dec;16(3):848-73.
Buonavoglia, D., Fasanella, A., Greco, G., Montagna, C., Scaltrito, D. (1998b) Infezione sperimentale di pecore con Mycoplasma agalactiae rilievi clinici, batteriologici e sierologici. In: Proceedings XIII Congresso Nazionale SIPAOC, Palermo 16-19 Aprile 1996, Italy, pp. 109-111
Lorusso A, Decaro N, Greco G, Corrente M, Fasanella A, Buonavoglia D. A real-time PCR assay for detection and quantification of M ycoplasma agalactiae DNA. J Appl Microbiol. 2007 Oct;103(4):918-23.
McAuliffe, L., Ellis, R., Ayling, R.D., Nicholas, R.A.J. (2003) Differentiation of M ycoplasma species by 16S ribosomal DNA PCR and denaturing gradient gel electrophoresis fingerprint. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4844-4847.
Roberto.puleio@izssicilia.it
Sidilv 2012

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