Diagnosi di infezione da Filovirus e Da febbre emorragica di Crimea Congo Concetta Castilletti concetta.castilletti@inmi.it National Institute for Infectious Diseases, INMI “L. Spallanzani”, Rome, Italy Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 1 La febbre emorragica di Congo-Crimea (CCHF) è un’infezione virale endemica in parte dell’Africa Africa, in Asia, nel sud est europeo e in Medio Oriente. L’agente eziologico, CCHFV, genere Nairovirus, famiglia Bunyaviridae, è causa di una zoonosi severa a rischio di trasmissione nosocomiale. L’infezione è direttamente correlata alla presenza nel territorio del vettore, una zecca appartenente nella maggior parte dei casi al genere Hyalomma. Il nome del virus e legato al luogo in cui per la prima volta è stata descritta la malattia, la Crimea nel 1944, ed al luogo in cui per la prima volta è stato isolato il virus, Congo nel 1956. Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Bunyaviridae • Family: Bunyaviridae • Genus: Orthobunyavirus Phlebovirus Hantavirus Tospovirus Nairovirus Genus Nairovirus (distinguished by L segment) has approximately 34 described tick-borne viruses that are grouped into seven serogroups. Among these, only three members are known to cause disease in humans and they are CCHF, Nairobi sheep disease virus, and Dugbe virus. 4 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 3 Schematic cross-section of a Bunyaviridae virion RNA singolo filamento a, polarità 3 segmenti - small (S, proteina nucleocapsidica) - medium (M, glycoproteina) - large (L, polimerasi virale) Il segmento M codifica anche per la proteina non-strutturale NSM di recente individuazione nel genoma del CCHFV Il Nucleocapside e l’RNA polimerasi RNA-dipendente sono contenute all’interno di un envelope lipidico che ancora le glicoproteine virali. Il virione presenta una forma sferica con un diametro di circa 100 nm, ed è ricoperto da un doppio strato lipidico acquisito durante il processo di gemmazione con uno spessore di circa 5-7 nm, al quale sono ancorate le glicoproteine virali di 8-10 nm di lunghezza. 5 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Ciclo replicativo 6 CCHFV comprende 6 clades geneticamente distinti basati sulla sequenza parziale del segmento S Bente DA et al Antiviral Res 2013 7 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 How is CCHF virus spread and how do human become infected ? CCHF virus circulates in a silent enzootic tick-vertebratetick cycle, and there is no evidence that the virus causes any disease in animals Ticks from the Hyalomma genus are both reservoir and the principal vectors of CCHF virus Hyalomma marginatum is the main vector for CCHF in southern Europe Hares and hedgehogs act as amplifying hosts for the immature stages of the ticks. Domestic animals (cattle, goats, sheep, etc.) are the usual hosts for the adult ticks Transmission to humans occurs following a tick bite or through contact with infected blood and tissues Many birds are resistant to infection, but ostriches are susceptible and may show a high prevalence of infection in endemic areas. 8 CDC CCHFV factsheet Virus spreads from the initial infection site to regional lymph nodes, liver and spleen, infects tissue macrophages and dendritic cells. Soluble factors released from infected monocytes and macrophages. Appannanavar 2011 Haemodynamic and coagulation disorders exacerbated by infection of hepatocytes and adrenal cortical cells. Reduced synthesis of albumin results in a reduced plasma osmotic pressure and edema. Impaired secretion of steroidsynthesizing enzymes by CCHFV−infected adrenal cortical cells leads to hypotension. Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 9 Symptoms of Crimean-Congo hemorrhagic fever - 1 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 10 Symptoms of Crimean-Congo hemorrhagic fever - 2 The average mortality rate is often reported at 3050% Rates as high as 72.7% and 80% have been reported from United Arab Emirates and China, respectively Mortality rates of nosocomial infection are often higher than those naturally acquired through tick bite (probably related to viral dose) For those who do not succumb to the disease, the convalescence period begins 15-20 days after onset of illness Sequelae (polyneuritis, headache, nausea, loss of memory, loss of hearing) are rarely permanent, but may persist for 1 year or more Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico 11 Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 12 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 13 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 15 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 CCHF geographic distribution Eastern and southern Europe Mediterranean area northwestern China central Asia Africa Middle East Indian subcontinent. 16 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 2009 2010 Reported human CCHF cases (A and B) and reported tick bites (C and D) in Southern Kazakhstan Knust EID 2012 17 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Humans become infected through bites of infected ticks or by contact with infected blood or other tissues of livestock. Risk groups are farmers, veterinarians and abattoir workers in endemic areas. Nosocomial transmission may occur through direct contact with infected blood or body fluids or contaminated medical equipment or supply Meat itself is not the source of infection because the virus is inactivated by postslaughter acidification of the tissue; and CCHFV does not survive cooking. Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. 18 Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Appannanavar 2011 19 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Prevention and control Prevention and control of CCHF infection is achieved by avoiding or minimising the exposure to infected ticks. Insect repellents containing DEET are effective in protecting against ticks. Wearing protective clothing and early and correct removal of ticks are recommended. Nosocomial cases of CCHF are quite common and often result in high mortality, strict universal precautions, including barrier nursing, should be taken with hospitalised cases, as with other haemorrhagic fevers. A vaccine derived from inactivated mouse brain is used in Bulgaria, but it is not widely available, and efficiency and safety have to be reevaluated, as well as specific human immunoglobulin used for postexposure prophylaxis. In endemic areas, a measure of tick control has been achieved by environmental sanitation of underbrush habitats. Acaricides may be useful on domestic animals to control CCHF virusinfected ticks if used 10–14 days prior to slaughter or to export of animals from enzootic regions. CDC CCHFV factsheet 20 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Ribavirin is the antiviral of choise The goal of therapy is the prevention of fatality Since there is no validated specific antiviral therapy for CCHF, treatment relies on supportive care, including the administration of thrombocytes, fresh frozen plasma, and erythrocyte preparations. Oral or intravenous ribavirin has been used with reported success, although not confirmed benefit for treatment has to be re-evaluated. In clinical practice was found to be beneficial, especially at earlier phase of infection Ribavirin was shown to be effective against CCHFV in vitro, in suckling mice, ribavirin treatment reduced CCHFV growth in the liver, significantly decreased viremia, significantly reduced mortality and extended the geometric mean time to death Ribavirin is the only antiviral drug used to treat viral hemorragic fever syndromes, including CCHF and Lassa fever Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico21 Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 22 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Esiste un vaccino sviluppato in Unione Sovietica nel 1970 , che è stato dimostrato indurre la produzione di anticorpi neutralizzanti in vitro. Un vaccino simile è tutt’ora utilizzato in Bulgaria nei soggetti a rischio. 23 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 EID 2012 24 Conclusioni 1 Necessità di metodi standardizzati e della validazione dei test utilizzati mediante EQA nei paesi di endemia. Stretta correlazione tra il paese di origine del paziente e la sensibilità del test utilizzaoto : qRT-PCR (p<0.001). Infatti, la qRT-PCR è risultata essere meno sensibile nella diagnosi di infezione da CCHFV nei pazienti provenienti soprattutto dalla Turchia e dall’Albania, rispetto a Iran, Kosovo, Albania, Turchia, ed Africa sub-sahariana Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico25 Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Conclusioni 2 The sensitivity of the selected molecular assays was found to be more modest (79.6% for qRT-PCR and 83.3% for LCD array) than for serologic methods and to be associated with the patient country of origin. This result is consistent with the finding that the application of molecular assays in different settings is hampered by the high diversity of the CCHFV genomes, whereas serologic methods can have a broader use due to cross-reactivities. In particular, the qRT-PCR seems to be less sensitive for patients originating from the Balkans region and Turkey than for patients from other countries compared with in-house reference molecular methods. The in-house methods developed by reference laboratories are optimized for detection of strains circulating in that area, which may result in a lower detection limit when compared with methods that cover a broader spectrum. 26 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Laboratory diagnosis: viral isolation Any attempts at isolating and culturing the virus should only be performed in a maximum biocontainment laboratory (i.e., BSL-4) The traditional method for CCHFV isolation has been by intracranial (i.c.) or intraperitoneal (i.p.) inoculation of a sample (e.g., blood from an acute-phase patient or ground tick pools) into newborn mice Isolation in cell culture: (easier, more rapid result, but less sensitive) virus can be isolated from blood and organ suspensions in a wide variety of susceptible cell lines including LLC-MK2,Vero, A549, HuH7, BHK-21, SW-13 At autopsy, virus is most likely to be found in the lung, liver, spleen, bone marrow, kidney and brain Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto 27 Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Laboratory diagnosis: Electronic microscopy Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto 28 Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Laboratory diagnosis: molecular assays CCHF Real-Time PCR VHF/VARIOLA-PCR / Contract No SSPE-CT-2003-502567 (Modified) Target: S segment, NP gene Position ref (NC_005302): 1068-1248 (181bp) Wölfel R, et al. Virus detection and monitoring of viral load in Crimean-Congo hemorrhagic fever virus patients. EID 2007 Platform: LightCycler 2.0 Master Mix: SuperScript III one-step qRT-PCR External Quality Assurance (EQA) for Crimean Congo Hemorrhagic Fever diagnostics 29 2011 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Detection of CCHFV genome in saliva and urine Bodun H et al. IJID 2010 30 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Laboratory diagnosis: serology CCHF specific IgM and IgG IFA on home-made slides Specific IgM persists for up to 4 months post-infection IgG remains detectable for at least 5 years. Negative sample IgM positive sample IgG positive sample Recent or current infection is confirmed by demonstrating using IgM antibody capture (MAC)-ELISA in a single sample, or a fourfold or greater increase in antibody titer in paired serum samples. For confirmation is also possible to perform microneutralization assay Recently, a recombinant nucleoprotein (rNP)-based IgG ELISA was developed for serological diagnosis of CCHF virus infections; this was shown to be a valuable tool for diagnosis and epidemiological investigations of CCHFV infections. Similarly, CCHFV rNP-based IgM-capture ELISA has shown to be a useful method for diagnosis of CCHFV infections. 31 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 CCHF : viral/antibody kinetics IgM IgG viremia 0 5 RT-PCR 10 16 Viral isolation Antibodies IgM duration: 2-3 months up to 6 months… 33 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Jabbari Anesthesia:2013 Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Differential Diagnosis 1 Due to the extended CCHFV geographical distribution (Africa, southern Europe, Middle East,Russia, India, and China), other viral etiologies have to be considered according to the origin of the patient and the risks of potential exposure: Alkhurma fever and Rift Valley fever in the Middle East; Omsk hemorrhagic fever in Russia; Kyasanur Forest disease in India; Hantaviruses in Europe and Asia; Lassa, Ebola, Marburg, Rift Valley fever, yellow fever in Africa; Dengue in various locations. In tropical and subtropical countries, malaria is the most important alternative diagnosis to be excluded in cases of suspected VHF. 34 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Differential Diagnosis 2 The differential diagnosis list should also include: hepatitis viruses, toxic shock syndrome, influenza, salmonellosis neisseria meningitidis, shigellosis, leptospirosis, psittacosis, borreliosis, trypanosomiasis, typhoid, septicemic plague, rickettsiosis, rubella, Q fever (Coxiella burnetii) measles, staphylococcal or gram-negative sepsis, hemorrhagic smallpox 35 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Filovirus: diagnostica di laboratorio National Institute for Infectious Diseases, INMI “L. Spallanzani”, Rome, Italy Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Divergenza genetica • Particella pleiomorfa, allungata, 80nm di diametro x 130-14,000nm di lunghezza dotata di envelope • Genome: singolo filamento di RNA a polarità negativa, lineare, non-frammentato • Codifica per 7 proteine Divergenza genetica Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Le proteine virali Gene NP: proteina NP strutturale di 83.3 Kd Gene L: RNA-polimerasi RNA dipendente Gene GP: glicoproteina GP (2 forme: trans-membrana e secretoria) Geni VP: VP40: proteina di matrice per la sua carica positiva facilita la gemmazione VP30: proteina fosforilata con funzione di attivazione e modulazione della trascrizione (incapsidamento RNA) VP35: proteina coinvolta in eventi trascrizionali; inibisce l’attivazione del sistema IFN contribuendo alla patogenicità dei filovirus VP24: proteina associata alla matrice; la funzione rimane ambigua 38 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 Outbreaks of Ebola Virus Diseases: the past 22 outbreaks, since 1976 •2322 cases, about 1700 deaths •Case fatality rate around 60-70% (up to 90%) •The oldest outbreak: Jul-Nov 1976 South Sudan 284 (deaths 151) •The biggest outbreak: Oct 2000Feb 2001 Uganda 425 (deaths 224) •Countries with previous outbreaks: South Sudan, Gabon, Ivory Coast, Uganda, Republic of Congo Pigott et al., Life 2014 Outbreaks of Ebola Virus Diseases: present West Africa >6000 Pigott et al., Life 2014 Origine della Epidemia in Africa Occidentale • Caso indice: bambino di due anni in Guinea, deceduto il 6 dicembre • 5 membri della sua famiglia si ammalano • Una ostetrica aiuta la famiglia, si ammala e trasmette ad altri 6 in un altro villaggio • Operatori sanitari dell’ospedale della vicina cittadina prestano assistenza ai malati e contraggono il virus • Con la partecipazione ai funerali si infettano altre 20 persone, che introducono il virus in altri distretti • L’epidemia è ormai innescata. Baize et al., NEJM 2014 I numeri di Ebola 2014 WHO roadmap update 26 settembre 2014 Country Total Cases Total Deaths Liberia 3,458 1,830 Sierra Leone 2,021 605 Guinea 1,074 648 Nigeria 20 8 Senegal 1 0 Total 6,574 3,091 DR Congo 70 42 I numeri dell’epidemia in corso, rispetto alle epidemie precedenti, sono incredibilmente più alti Distribuzione geografica attuale MVE dinamica delle epidemie Olival, Viruses 2014 Bat species found filovirus positive by serology or PCR Bats: a Pandora’s box for emerging viruses Bats are an ancient mammals group (65 millions years ago) Geographic range for potential bat host Reston ebolavirus Marburgvirus Lloviu virus Zaire ebolavirus Olival, Viruses 2014 Predicted geographical distribution of the three species of Megachiroptera suspected to reservoir Ebola virus hammer-headed bat (Hypsignathus monstrosus) Franquet's epauletted fruit bat (Epomops franqueti) little collared fruit bat (Myonycteris torquata) MVE dinamica delle epidemie Pigott et al., Life 2014 Bushmeat on sale Filovirus pathogenesis GP media l’ingresso del virus nella cellula ospite e favorisce i meccanismi di escape. Il virus si diffonde attraverso il torrente circolatorio e si replica attivamente in: • macrofagi/monociti • cellule dendritiche • cellule endoteliali • organi (fegato, rene, milza, ovaio, testicoli ed organi linfatici) le lesioni principali sembrano essere a carico dell’endotelio vascolare. Feldmann, Lancet 2011 The standard treatment for Ebola remains supportive therapy. This includes the following measures: • balancing the patients' fluids and electrolytes; • maintaining their oxygen status and blood pressure; and • treating them for any complicating infections. The most effective way to stop the current Ebola outbreak in West Africa is meticulous work in finding Ebola cases, isolating and caring for those patients, and tracing contacts to stop the chains of transmission It means educating people about safe burial practices and having health care workers strictly follow infection control in hospitals This is how all previous Ebola outbreaks have been stopped Perché una così grande epidemia? • Una epidemia da virus Ebola sarebbe, in teoria, relativamente facile da contenere • Il periodo di incubazione è abbastanza lungo (circa 7 giorni in media) e quindi consente una ricerca dei contatti; • La patologia non sembra essere trasmissibile in assenza di sintomi, e quindi basterebbe isolare i malati in fase sintomatica; • Le precauzioni standard e da contatto si sono dimostrate efficaci nel prevenire la maggioranza delle trasmissioni Perché una così grande epidemia? • Povertà • Situazione drammatica dei sistemi sanitari assistenziali; • Inesistenza/inefficienza di strutture di sanità pubblica; • Frontiere molto facili da attraversare; • Scarsa collaborazione (ed evidente ostilità delle popolazioni locali); • Paura, credenze locali, stigma; • Sottostima del problema e lentezza degli interventi di aiuto internazionale. Perché una così grande epidemia? Povertà e scarsità di risorse sanitarie • Secondo l’Indice di Sviluppo Umano (HDI) 2014, su 187 paesi i tre paesi colpiti (Liberia, Guinea, Sierra Leone) sono rispettivamente in posizione 175, 179, 183; – Norvegia 1, Italia 26, Niger 187 • Due tra questi paesi escono da una lunga guerra civile; • In Liberia, ogni 100.000 persone, sono presenti 1 medico e circa 17 tra infermieri e ostetriche; • Le strutture di sanità pubblica deputate al monitoraggio delle epidemie sono inefficaci; • Le procedure di Infection Control all’interno degli ospedali sono sostanzialmente inesistenti. Perché una così grande epidemia? Frontiere molto “porose” • La ricerca di lavoro porta molte persone a spostarsi quotidianamente tra i diversi paesi nelle zone di frontiera; • Spesso le frontiere dividono popoli della stessa etnia, o dello stesso gruppo familiare; • La partecipazione ai funerali di membri della propria famiglia ha costituito la modalità di ingresso del virus in Sierra Leone. Chan M, NEJM 2014 Kucharski J, Eurosurv 2014 Guinea Sierra Leone Liberia Parametri epidemiologici della epidemia di EVD in corso in Africa Occidentale (WHO Ebola Response Team, NEJM, Sept 2014) 61 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 63 64 Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014 65 Diagnostica differenziale • Malaria • Dengue • • • • • • • • • Febbre tifoide Shigellosi Colera Leptospirosi Peste Rickettsiosi Febbre ricorrente Borreliosi da pidocchi Meningiti e sepsi • Epatiti • Altre febbri emorragiche virali Algoritmo di laboratorio Blood specimens sent to BSL3/4 VHF national reference laboratory Ricerca del virus mediante test di biologia molecolare Rilevazione di una sequenza genica Conferma dei positivi con un metodo basato su un target diverso, ed esecuzione di una PCR classica Caratterizzazione mediante sequenziamento della regione amplificata con PCR classica Real-time PCR semi-quantitativa per il monitoraggio clinico 68 Cinetica dell’RNA (SUDV Uganda 2000) L’RNA virale è presente ad alti titoli fino a 10 g dopo inizio sintomi; la sensibilità dei test non è un problema rilevante Towner, J Virol 2004 Available molecular methods; In house Target(s) Source Technique EBOV, VP24 EBOV, NP SUDV, NP EBOV, NP PanFiloviridae, L PanFiloviridae, L Pan-Ebolavirus, NP EBOV, NP EBOV, GP SUDV, NP SUDV, GP TAFV, GP 1 TAFV, GP 2 BDBV, NP REST, VP40 REST, GP Pan-Ebolavirus*, L EBOV, NP EBOV, 5' trailer region Pan-Filovirus*, L EBOV, NP SUDV, NP EBOV, SUDV, NP Pan-Ebolavirus, L Pan-Ebolavirus, GP Pan-Filovirus*, L Pan-Ebolavirus8, GP EBOV, NP RESTV, NP EBOV, GP 1 EBOV Gabon, L Gire Euler Euler Huang Grard Grard 2011 Ogawa Trombley Trombley Trombley Trombley Trombley Trombley Trombley Trombley Trombley Zhai Towner 2007 Kurosaki Panning Weidmann Weidmann Towner 2004 Drosten Gibb Sanchez Sanchez Sanchez Sanchez Morvan Morvan conventional RPA RPA hydrolysis probe conventional conventional conventional hydrolysis probe hydrolysis probe hydrolysis probe hydrolysis probe hydrolysis probe hydrolysis probe hydrolysis probe hydrolysis probe hydrolysis probe conventional hydrolysis probe RT-LAMP hydrolysis probe hydrolysis probe Hydrolysis probe conventional (nested) SYBR green (based (62)) hydrolysis probe conventional conventional conventional conventional Conventional (nested) Conventional (nested) EQA restricted to VHF reference BSL4 laboratories have been carried out all the known ebolavirus species (Euronetp4 network unpublished data, GHSAG-LN) All other PCR tests are primarily targeting EBOV, sometimes in combination with SUDV. An alignment of EBOV sequences available in GenBank, including all available strains from the current outbreak (n=101) was made for the assessment of the in-house developed primer sets. This demonstrated that in most primer sets some mismatches with EBOV exist. Based on the alignment it can be concluded there is a 100% match for the primer sets described by Grard , Ogawa and Gibb , BUT the primer sets by Grard and Ogawa show a relatively great number of degenerative nucleotides which might decrease sensitivity. Primer sets by Gire , Zhai , Panning , Weidmann , Drosten , Sanchez EBOV-GP and Morvan do have 1 or 2 mismatches but the position in the primers is such (>5 nucleotides from 3’-end) that a loss of sensitivity is not expected. Available molecular methods; commercially available Filovirus Altona Real Star®Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0; Ebola Genekam Ebola (Common) PCR kit, (Zaire) PCR kit, (Reston) PCR kit, (Zaire) PCR kit, (Sudan) PCR kit Liferiver (Vacunek) (EBOV) Real Time RT-PCR kit Lipsdiag LIPSGENE® SEBOV Kit (Sudan) / ZEBOV Kit (Zaire) Sacace Ebola Zaire Real Time PCR kit Genesig Ebola Real Time PCR kit, Path-EBOV (Zaire) / Path-SUDV (Sudan) Tib Molbiol Ebola (Zaire) Real Time PCR kit Marburg Liferiver (Vacunek) (MBV) Real Time RT-PCR kit Genekam Marburg PCR kit There is no information in literature on performance commercial tests Rivelazione della risposta umorale e cellulare specifica •Risposta umorale: eseguita mediante metodi appositamente allestiti in laboratorio (immunofluorescenza indiretta e test di sieroneutralizzazione. •Per la risposta cellulare vengono eseguite colture di linfomonociti esposti agli agenti identificati, e la rilevazione delle sottopopolazioni linfocitarie attivate viene eseguita mediante rilevazione citofluorimetrica delle citochine intracitoplasmatiche. 72 Anticorpi La ricerca degli anticorpi in genere ha valore di documentazione retrospettiva •Le IgM compaiono dopo 3 giorni e sono fugaci (< 3 settimane) •Le IgG persistono a lungo e sembrano essere protettive Cinetica della comparsa di IgG e IgM EBOV (Kikwit, DCR 1995) IgM IgG Ksiazek, JID 1999 Immunofluorescenza indiretta Negative control IgM positive sample IgG positive sample Identificazione del virus •Isolamento virale in colture di tessuto (BSL4) e successiva caratterizzazione degli isolati con metodi immunologici o molecolari. •In casi particolari è previsto anche lo studio morfologico in Microscopia Elettronica, sia sull’isolato che sul campione biologico iniziale. 78 79 Senova's prototype rapid diagnostic for Ebola virus is being tested in Guinea. G Vogel Science 2014;345:1549-1550 26.03.14 First team and EMLab leave Munich ang go to Guinea (final destination Gueckedoù) Technology and equipment: Outline of Lab min. 10 m² min. 9 m² 6 5 1 1 6 2 3 5 3 2 4 Trasporto dei campioni (ipoclorito 0,5%) Organizzazione del lavoro Accettazione Inattivazione Estrazione / Master mix Real Time RT-PCR Refertazione Avvicendamento……. 05.09.14 First team and third EMLab leave Rome and go to Liberia (final destination Foya) 26.03.14 from Munich to Guéckédou, 05.09.14 Guinea from Rome to Foya, Liberia
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