Come e quando fare i test Antonino Di Caro INMI Come e quando fare il test Antonino Di Caro, antonino.dicaro@inmi.it Maria Rosaria Capobianchi, maria.capobianchi@inmi.it Concetta Castilletti, concetta.castilletti@inmi.it Il virus ebola, come gli altri filovirus, è un virus di gruppo di rischio 4 •Alta contagiosità •Elevata mortalità •Assenza di terapia specifica •Assenza di vaccini La diagnostica per virus di gruppo di rischio 4 non è assimilabile ad analoghe procedure per microrganismi di gruppo inferiore, in quanto presenta requisiti strutturali, professionali ed organizzativi peculiari. Difficoltà per la diagnosi di laboratorio degli agenti di gruppo di rischio 4  Necessità, specie in assenza di un sospetto clinico ben indirizzato, di una diagnosi differenziale ad ampio spettro  Scarsità/assenza di kit commercialmente disponibili, validati  Scarsità di materiali di riferimento per lo sviluppo e la validazione dei metodi diagnostici  Necessità di partecipare ai network internazionali per poter accedere a: metodi, materiali/agenti, EQA, assistenza/conferme dei risultati  Necessità di sviluppare, spesso in fretta, metodi nuovi e, in assenza di standard di riferimento, di sviluppare metodi di conferma  Necessità di laboratori ad alto biocontenimento Come effettuare la diagnosi di laboratorio di Malattia da Virus Ebola La circolare del Ministero della Salute 0026708-06/10/2014 indica i seguenti criteri di laboratorio, almeno uno dei quali è necessario per la conferma di un caso di MVE CRITERIO DI LABORATORIO: La positività ad uno dei seguenti: • Individuazione di acido nucleico del virus Ebola in un campione clinico e conferma mediante sequenziamento o un secondo test su una diversa regione del genoma; • Isolamento del virus Ebola da un campione clinico; • Evidenza di sieroconversione Vanno testati solamente i casi e non i contatti, a meno che questi ultimi non manifestino sintomi rientrando , di conseguenza, nella definizione di caso. Non sono attualmente disponibili test in grado di evidenziare l’infezione nei contatti, ovvero durante il periodo di incubazione Considerazioni sui livelli di biosicurezza • La ricerca dell’acido nucleico virale viene effettuata con metodi molecolari • I tamponi di lisi utilizzati per l’estrazione degli acidi nucleici (es. AVL) inattivano l’infettività virale • L’aggiunta del tampone di lisi al campione clinico deve essere effettuata ad un livello di biosicurezza commisurato alla valutazione del rischio; è raccomandato come livello minimo il BSL3 • le fasi di estrazione ed amplificazione possono essere eseguite in condizioni di biosicurezza 2 (BSL2) • L’isolamento del virus va effettuato in laboratorio a livello di biosicurezza 4 • Allo stesso livello deve essere effettuata la manipolazione e la conservazione di tutti i campioni positivi • La sieroconversione viene valutata mediante metodi non commerciali, il cui allestimento richiede la disponibilità di colture virali, e quindi di laboratorio a livello di biosicurezza 4 I laboratori di riferimento •In base a queste premesse, la circolare del Ministero della Salute 002670806/10/2014 dispone che la ricerca degli acidi nucleici virali venga eseguita in laboratori identificati dalle regioni, dotati almeno di livello di biosicurezza 3 •I laboratori abilitati alla manipolazione degli agenti di gruppo di rischio 4 (presso gli istituti Spallanzani e Sacco) possono effettuare i test che necessitano la coltura del virus e conservare i campioni biologici positivi •I laboratori di riferimento identificati dalle regioni e comunicati al Ministero della Salute saranno inseriti in un processo di qualificazione con la collaborazione del centro di riferimento nazionale per la diagnosi di Febbri Emorragiche Virali, presso l’Istituto Nazionale per le Malattie Infettive “L.Spallanzani”. •In attesa della conclusione di tale processo di qualificazione, tutti i campioni per la diagnosi eziologica di MVE devono essere inviati contemporaneamente anche all’INMI “L. Spallanzani Indagini ematochimiche per la diagnosi differenziale e per il monitoraggio clinico del paziente Emocromo elettroliti transaminasi coagulazione ecc. • Le indagini chimico-cliniche possono essere eseguite in loco, privilegiando POCT (Point of Care Testing) o sistemi chiusi che consentano ad es. di forare la provetta e di centrifugarla, ove necessario, in modo automatico • Le provette contenenti i campioni vanno sempre aperte sotto cappa, proteggendo occhi e mucose da eventuali spruzzi • Se non si dispone di un laboratorio in grado di osservare queste misure, inviare i campioni ai laboratori di riferimento regionali o a quello nazionale Dove effettuare il testeffettuare il test • La circolare del Ministero della Salute 0026708-06/10/2014 dispone che per gli esami ematochimici ed i test per le diagnosi differenziali, nei casi sospetti/probabili di MVE, sia individuato un laboratorio di riferimento che, in base alla valutazione del rischio, effettuata dalla struttura di malattie infettive di riferimento regionale, definisca le procedure per il trasporto ed il processo dei campioni Capacità diagnostiche per Ebola presso il laboratorio nazionale di riferimento • Ricerca diretta del virus mediante metodi molecolari basata su un test iniziale di screening e vari test successivi di conferma • Caratterizzazione molecolare mediante sequenziamento ed analisi filogenetica • Ricerca diretta del virus mediante metodi colturali • Ricerca diretta del virus mediante microscopia elettronica • Ricerca degli anticorpi mediante Immunofluorescenza indiretta (IgM e IgG) • Ricerca di anticorpi mediante test di neutralizzazione • Diagnosi differenziale verso le principali eziologie alternative, nonché verso altre cause di sindromi emorragiche, incluse Lassa, Dengue, Alkhurma, febbre gialla, ecc. Le malattie infettive rilevanti per la diagnostica differenziale • Malaria • Dengue • • • • • • • • • Febbre tifoide Shigellosi Colera Leptospirosi Peste Rickettsiosi Febbre ricorrente Borreliosi da pidocchi Meningiti e sepsi • Epatiti • Altre febbri emorragiche virali Come contattare il laboratorio di riferimento nazionale Prima di inviare campioni al laboratorio di riferimento nazionale presso l’Istituto nazionale per le Malattie Infettive L. Spallanzani , è necessario contattare il virologo di turno. Il Laboratorio di Virologia è attivo h24. Il virologo di turno può essere reperito ai seguenti numeri: • 0655170666 • 3204343793 Il virologo di turno effettuerà con il richiedente la valutazione congiunta preliminare, e provvederà ad attivare le procedure interne. • Grazie per l’attenzione Valutazione del rischio I campioni dei pazienti sospettati di MVE e che rientrano nella definizione di caso dovrebbero essere trattati utilizzando un strategia di stratificazione dei rischi, che tenga conto di • esistenza ed entità del link epidemiologico  provenienza da zone dove l’epidemia ha un’alta diffusione  aver frequentato strutture ospedaliere  aver avuto contatti diretti con persone infette  aver frequentato funerali rituali • gravità della sintomatologia • eventuale mancato miglioramento dei sintomi a seguito dei trattamenti terapeutici  persistenza della febbre nonostante il trattamento antimalarico in pazienti con parassitemia Preparazione dei campioni.1 • Il campione di scelta per la ricerca del virus è sangue-EDTA (no eparina) • I campioni vanno mantenuti a +4°C prima dell’invio • Il trasporto al Laboratorio deve essere effettuato entro il più breve tempo possibile, preferibilmente entro le 24 ore e a temperatura refrigerata • Per tempi di consegna più prolungati, concordare con il Laboratorio le modalità di preparazione e conservazione Preparazione dei campioni.2 • I prelievi devono essere accompagnati dalla scheda dati, compilata in tutte le sue parti • Su ogni singolo campione deve essere apposta un’etichetta riportante a chiare lettere il nome del paziente, la tipologia del campione (sangue, urine, altro) e la data di prelievo. • Le informazioni riportate sulle provette devono essere coerenti con quelle inserite nella scheda dati Confezionamento e trasporto dei campioni • Il campione va confezionato seguendo il principio del triplo involucro • Il trasporto dei campioni al laboratorio va eseguito secondo le raccomandazioni per i campioni a rischio biologico (Circolare Ministeriale n°3/2003 “Raccomandazioni per la sicurezza del trasporto di materiali infettivi e di campioni diagnostici”) L’invio va concordato con il Laboratorio Come e quando fare i test Antonino Di Caro INMI