elenco non ammessi alla selezione scritta

DCM123-1
Ed. 03/2012
ZnT8 Ab
per analisi di routine
Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa dello ZnT8 (Zinc Transporter 8) nel siero
umano
LOT
IVD
See external label
DESTINAZIONE D’USO
Il kit ELISA Diametra ZnT8 è destinato all'uso da parte di
sole persone professioniste per la determinazione
quantitativa di autoanticorpi anti ZnT8 nel siero umano. Gli
anticorpi contro gli antigeni delle cellule beta del pancreas
sono importanti marcatori sierologici del Diabete Mellito di
tipo 1. Gli antigeni riconosciuti da questi anticorpi
includono l'insulina, l’acido glutammico decarbossilasi
(isoforma GAD65), l'antigene delle cellule insulari IA-2 o
ICA-512 e il trasportatore di zinco 8 (ZnT8). Gli
autoanticorpi anti ZnT8 sono diretti principalmente contro il
dominio C-terminale di ZnT8 (residui 268-369).
Il polimorfismo genetico nella popolazione umana al
codone dell’amminoacido 325 porta all’espressione di tre
varianti proteiche: Arginina (R) 325, triptofano (W) 325 e
molto raramente glutammina (Q) 325. Gli autoanticorpi anti
ZnT8 possono essere specifici per la variante R 325 o W
325, o possono essere non specifici per il residuo 325.
Sieri che reagiscono solamente con l'allele Q sono
estremamente rari. Il kit ELISA Diametra ZnT8 è in grado di
rilevare e quantificare, autoanticorpi specifici per R 325 o
W 325, o per varianti non specifiche del residuo 325.
1. PRINCIPIO DEL SAGGIO
Nel kit ELISA Diametra ZnT8, gli autoanticorpi anti ZnT8
presenti nel siero dei pazienti, nei calibratori e nei controlli
interagiscono con lo ZnT8 adsorbito sui pozzetti della
micropiastra. Dopo un’incubazione di 16-20 ore, l’eccesso
viene scartato lasciando gli autoanticorpi anti ZnT8 legati ai
pozzetti della micropiastra coattati con ZnT8. Nel secondo
step di incubazione viene aggiunta la Biotina; grazie
all’abilità degli autoanticorpi anti ZnT8 nel campione di
agire bivalentemente (o polivalentemente), si forma un
ponte tra lo ZnT8 immobilizzato sulla micropiastra e la
Biotina.
La Biotina non legata è successivamente rimossa da uno
step di lavaggio, mentre la quantità di Biotina legata è
determinata in un terzo step di incubazione attraverso
l’addizione della Streptapidina Perossidasi (SA-POD), che
lega specificatamente la Biotina. L’eccesso di SA-POD non
legata è lavata via e l’addizione successiva di 3,3’,5,5’tetramethylbenzidine (TMB) porta alla formazione di un
colore blu. Questa reazione è fermata dall’addizione della
Stop Solution, che produce un cambiamento di colorazione
verso il giallo. L’assorbanza della soluzione gialla a 405 nm
e 450 nm è quindi letta usando un lettore di piastre ELISA.
Un’alta assorbanza indica la presenza di autoanticorpi anti
ZnT8 nel campione. La lettura a 405 nm permette la
quantificazione ad alte assorbanze. I valori bassi (inferiori a
50 U/mL) dovrebbero essere letti a 450 nm. Il range di
misurazione è 10-2000 AU/mL.
Σ = 96 test
REF DKO123
2.
CONSERVAZIONE
E
PREPARAZIONE
DEL
CAMPIONE SIERICO
I sieri dovrebbero essere analizzati immediatamente dopo
la separazione dal resto del sangue o conservati,
preferibilmente in aliquote, sotto i -20°C. 50 µL di campione
sono sufficienti per un saggio (in duplicato). Evitare
congelamenti e scongelamenti ripetuti o l’aumento della
temperatura di conservazione. Non usare campioni sierici
lipemici o emolizzati. Può essere usato plasma in EDTA.
Quando richiesto, portare i sieri a temperatura ambiente e
agitare
gentilmente
per
assicurare
l’omogeneità.
Centrifugare i sieri prima del saggio (preferibilmente per 5
minuti a 10-15000g in una micro centrifuga) per rimuovere
eventuale materia particellare. Non ignorare questa
centrifugazione se i sieri sono torbidi o contengono
particolati.
3. MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI
Pipette adatte alla dispensazione di volumi di 25 e 100 µL.
Oggettistica di laboratorio per la misurazione dei volumi, la
ricostituzione e la diluizione dei reagenti.
Lettore di piastre ELISA adatto per il formato a 96 pozzetti
e capace di misurazioni a 450 e 405 nm.
Agitatore di piastre ELISA , capaci di 500 agitazioni/minuto
(no agitatori orbitali).
Copertura per piastre ELISA.
4. PREPARAZIONE DEI REAGENTI FORNITI
Conservare i reagenti non aperti a 2-8°C.
1. Microplate
REF DCE002/12303-0
12 strip frazionabili con 8 pozzetti (96 in totale) in una
cornice e sigillate in una busta di alluminio.
Assicurarsi che le strip siano saldamente inserite nella
cornice fornita. Dopo l’uso rimettere le strip inutilizzate nella
busta di alluminio originale con l’essiccante e chiudere con
nastro adesivo. Porre la busta di alluminio dentro una busta
di plastica richiudibile e conservare a 2-8°C per un
massimo di due settimane.
2. Calibrators (5 flaconi, 0.7 mL ciascuno, pronti all’uso)
CAL1
- 10 AU/mL
REF DCE002/12306-0
CAL2
- 20 AU/mL
REF DCE002/12307-0
CAL3
- 75 AU/mL
REF DCE002/12308-0
CAL4
- 500 AU/mL
REF DCE002/12309-0
CAL5
- 2000 AU/mL
REF DCE002/12310-0
(AU sono unità arbitrarie Diametra)
3. Positive Controls (2 flaconi, 0.7 mL ciascuno, pronti
all’uso)
Vedere l’etichetta per la concentrazione.
REF DCE045/12304-0 e REF DCE045/12305-0
4. Negative Control (1 flacone, 0.7 mL, pronto all’uso)
REF DCE045/12301-0
5. ZnT8 Biotin (3 flaconi, liofilizzati)
REF DCE019/12319-0
Ricostituire ogni flacone con 5,5 mL di ZnT8 Biotin buffer
(reagente 6). Se si utilizza più di un flacone, unire i flaconi
e agitare delicatamente prima dell’uso. Conservare a 2-8°C
per un massimo di 3 giorni dopo la ricostituzione.
6. ZnT8 Biotin buffer (2 flaconi, 15 mL ciascuno, colore
rosso, pronto all’uso)
REF DCE047/12347-0
7. 20X Streptavidin Peroxidase (SA-POD)
(1 flacone, 0.7 mL, concentrato)
REF DCE041/12341-0
Diluire 1:20 con SA-POD diluent (reagent 8) prima dell’uso.
Per esempio, 0,5 mL (reagent 7) + 9,5 mL (reagent 8).
Conservare a 2-8°C per un massimo di 16 settimane dopo
la diluizione.
8. SA-POD diluent (1 flacone, 15 mL, pronto all’uso)
REF DCE048/12348-0
9. TMB Substrate (1 flacone, 15 mL, pronto all’uso)
REF DCE004/12304-0
10. 10X Conc. Wash Solution (1 vial, 125 mL)
REF DCE054/12354-0
Diluire 10 volte con acqua deionizzata prima dell’uso. Per
esempio, 100 mL (reagent 10) + 900 mL di acqua
deionizzata. Conservare a 2-8°C fino alla data di scadenza.
11. Stop Solution (1 flacone, 12 mL, pronto all’uso)
REF DCE005/12305-0
5. PROCEDURA DEL SAGGIO
Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (22-28°C),
eccetto lo ZnT8 Biotin e lo ZnT8 Biotin buffer. E’
raccomandato l’utilizzo di una pipetta Eppendorf a
ripetizione. Effettuare il saggio in duplicato per ogni
Calibratore, Controllo, Siero e lasciare due pozzetti vuoti
per il Bianco.
Giorno 1
Reagente
Calibratore
CAL1-CAL5
Calibratore
Campione/
Controlli
Bianco
25 µL
Controllo
25 µL
Campione
25 µL
Coprire la piastra, agitare per circa 5 secondi in un
agitatore per piastre ed incubare overnight (per 16-20
ore) a 2-8°C senza agitazione.
Giorno 2
Utilizzare un washer per piastre ELISA per lavare 3 volte
la piastra con Wash Solution diluita. Se non è disponibile
un washer, eliminare il contenuto dei pozzetti rovesciando
la micropiastra sopra un contenitore per rifiuti, lavare 3
volte manualmente e infine sbattere delicatamente la
micropiastra su fogli di carta asciutti ed assorbenti.
ZnT8 Biotin
ricostituita
fresca
100 µL
100 µL
Coprire la piastra e incubare a 2-8°C per 1 ora senza
agitazione.
Utilizzare un washer per piastre ELISA per lavare 3 volte
la piastra con Wash Solution diluita. Se non è disponibile
un washer, eliminare il contenuto dei pozzetti rovesciando
la micropiastra sopra un contenitore per rifiuti, lavare 3
volte manualmente e infine sbattere delicatamente la
micropiastra su fogli di carta asciutti ed assorbenti.
SA-POD
diluita
100 µL
100 µL
Coprire la micropiastra ed incubare a temperatura
ambiente (22-28°C) per 20 minuti in un agitatore per
piastre ELISA (500 shakes/min).
Utilizzare un washer per piastre ELISA per lavare 3 volte
la piastra con Wash Solution diluita. Se non è disponibile
un washer, eliminare il contenuto dei pozzetti rovesciando
la micropiastra sopra un contenitore per rifiuti, lavare 3
volte manualmente e infine sbattere delicatamente la
micropiastra su fogli di carta asciutti ed assorbenti.
Se è stato effettuato il lavaggio in manuale, lavare la
piastra un’altra volta con acqua deionizzata per rimuovere
ogni residuo di schiuma.
TMB
Substrate
100 µL
100 µL
100 µL
Incubare al buio a temperatura ambiente (22-28°C) per
20 minuti senza agitazione.
Stop
Solution
100 µL
100 µL
100 µL
Agitare la piastra per circa 5 secondi in un agitatore per
micropiastre. Assicurarsi che il tempo di incubazione del
TMB Substrato sia lo stesso per tutti i pozzetti.
Entro 5 minuti leggere l’assorbanza a 405 nm, poi a 450
nm, usando un lettore di piastre ELISA; effettuare il
Bianco contro i pozzetti contenenti solo il TMB e la Stop
Solution.
6. ANALISI DEI RISULTATI
La curva di calibrazione può essere determinata plottando la
concentrazione dei calibratori sull’asse delle x (scala
logaritmica) contro l’assorbanza dei Calibratori sull’asse
delle y (scala lineare).
La concentrazione di autoanticorpi anti ZnT8 nei sieri può
essere quindi estrapolata dalla curva di calibrazione.
Possono essere utilizzati anche altri sistemi di analisi dei
dati. Il Controllo Negativo ha una concentrazione di 0
AU/mL, ma gli può essere assegnato il valore di 1 AU/mL
per facilitare l’analisi dei dati al computer. I campioni con
concentrazioni elevate di ZnT8 possono essere diluiti con il
Controllo Negativo (reagente 4); per esempio, 15 µL di
campione + 135 µL di Controllo Negativo per ottenre una
diluizione 1:10. Ulteriori diluizioni (ad es. 1:100) possono
essere preparate dalla diluizione 1:10 come appropriato.
Alcuni sieri non si diluiscono in maniera lineare.
RISULTATI TIPICI (solamente come esempio, non
utilizzare per il cacolo di risultati reali)
Calibratori
CAL1
CAL2
CAL3
CAL4
CAL5
Controllo NEG
Controllo POS 1
Controllo POS 2
Assorbanza
405 nm
450 nm
0.016
0.060
0.037
0.134
0.203
0.673
0.973
3.222
2.276
7.738
0.002
0.008
0.137
0.463
0.477
1.596
AU/mL
10
20
75
500
2000
0
60
134
Le letture di assorbanza a 405 nm possono essere
convertite in valori di assorbanza a 450 nm moltiplicando per
un fattore di conversione appropriato (3,4 nel caso del kit
Diametra).
9.
CONSIDERAZIONI DI SICUREZZA
Il kit è destinato ad utilizzo in vitro da parte di personale
esperto. Seguire attentamente le istruzioni. Osservare le
date di scadenza riportate sulle etichette e la stabilità
specificata per i reagenti ricostituiti. Riferirsi alla MSDS per
informazioni maggiormente dettagliate sulla sicurezza. Tutti i
reattivi di origine umana usati nella preparazione dei
reagenti del kit sono stati testati e sono risultati negativi per
la presenza di anticorpi anti-HIV 1&2, per HbsAg e per
anticorpi anti-HCV, ma, ciò nonostante, devono essere
manipolati come potenzialmente infetti. Lavare le mani
abbondantemente se è avvenuta una contaminazione e
prima di lasciare il laboratorio. Sterilizzare tutti i rifiuti
potenzialmente contaminati, inclusi i campioni sierici, prima
dello smaltimento. I materiali di origine animale usati nella
preparazione dei reagenti sono stati certificati come sani,
ma dovrebbero essere trattai come potenzialmente infettivi.
Alcuni reagenti contengono piccole quantità di sodio azide
come preservante. In riferimento a tutti i componenti del kit,
evitare l’ingestione, l’inalazione o il contatto con la pelle, gli
occhi e i vestiti. Evitare la formazione di azidi metalliche nei
tubi di scarico lavando sempre copiosamente con acqua
abbondante.
10. BIBLIOGRAFIA
• J. M. Wenzlau et al., “The cation efflux transporter ZnT8
(Slc30A8) is a major autoantigen in human type I
diabetes.” PNAS 2007 104:17040-17045
• P. Achenbach et al., “Autoantibodies to zinc transporter
8 and SLc30A8 genotype stratify type 1 diabetes risk.”
Diabetologia 2009 52:1881-1888
Fabbricato sotto licenza in Europa con brevetto n°
1563071; in attesa di brevetto per altri paesi.
Ed. 03/2012
DCM123-1
DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, 18 – 20090
SEGRATE (MI) Italy
Tel. 0039-02-2139184 – 02-26921595
Fax 0039–02–2133354.
Manufactory: Via Pozzuolo 14, 06038 SPELLO (PG) Italy
Tel. 0039-0742–24851
Fax 0039–0742–316197
E-mail: info@diametra.com
7.
CUT-OFF DEL SAGGIO
Cut-off
Negativo
Positivo
AU/mL
< 15 AU/mL
≥ 15 AU/mL
8. SPECIFICITA’ E SENSIBILITA’ CLINICHE
In uno studio del 2010 il kit Diametra ZnT8 ELISA ha
mostrato una specificità del 99% (n=90) ed una sensibilità
del 68% (n=50).
I dati presenti in queste Istruzioni per l’Uso devono essere
usati solo come una guida. E’ raccomandato che ogni
laboratorio includa il suo proprio pannello di campioni nel
saggio. Ogni laboratorio dovrebbe stabilire i propri range di
riferimento normali e patologici per gli autoanticorpi antiZnT8.
DCM123-1
Ed. 03/2012
ZnT8 Ab
for routine analysis
Enzyme immunoassay for the quantitative determination of Zinc Transporter 8 (ZnT8) autoantibodies in
human serum
LOT
IVD
See external label
INTENDED USE
Diametra ZnT8 autoantibody (ZnT8 Ab) ELISA kit is
intended for use by professional persons only, for the
quantitative determination of ZnT8 autoantibodies in
human serum. Autoantibodies to pancreatic beta cell
antigens are important serological markers of type 1
diabetes mellitus (type 1 DM). The antigens recognised by
these antibodies
include insulin, glutamic acid
decarboxylase (GAD65 kDa isoform), the islet cell antigen
IA-2 or ICA-512 and zinc transporter 8 (ZnT8). ZnT8
autoantibodies are directed principally to the C terminal
domain of ZnT8 (residues 268 – 369). Human population
th
gene polymorphism at the codon for the 325 amino acid
results in the expression of three protein variants: Arginine
(R) 325, Tryptophan (W) 325 and very rarely Glutamine (Q)
325. ZnT8 autoantibodies may be specific to the R 325 or
W 325 variant, or may be residue 325 non-specific. Sera
that react with the Q allele only are extremely rare.
DIAMETRA’s ZnT8 autoantibody ELISA is capable of
detecting, and quantifying, autoantibodies specific to R 325
or to W 325, or to residue 325 non-specific variants.
1. ASSAY PRINCIPLE
In DIAMETRA’s ZnT8 Ab ELISA, ZnT8 autoantibodies in
test patients’ sera, calibrators and controls are allowed to
interact with ZnT8 coated onto ELISA plate wells. After a
16 - 20 hour incubation, the samples are discarded leaving
ZnT8 autoantibodies bound to the ZnT8 coated wells. ZnT8
Biotin is added in a 2nd incubation step where, through the
ability of ZnT8 autoantibodies in the samples to act
bivalently (or polyvalently), a bridge is formed between
ZnT8 immobilised on the plate and ZnT8 Biotin.
Unbound ZnT8 Biotin is then removed in a wash step and
the amount of bound ZnT8 Biotin determined (in a 3rd
incubation step) by addition of Streptavidin Peroxidase
(SA-POD), which binds specifically to Biotin. Excess,
unbound SA-POD is then washed away and addition of
3,3’,5,5’ – tetramethylbenzidine (TMB) results in formation
of a blue colour. This reaction is stopped by addition of
stop solution causing the well contents to turn yellow. The
absorbance of the yellow reaction mixture at 405 nm and
450 nm is then read using an ELISA plate reader. A higher
absorbance indicates the presence of ZnT8 autoantibody
in the test sample. Reading at 405 nm allows quantitation
of high absorbances. Low values (less than 50 units per
mL) should be read off the 450 nm calibration curve. The
measuring range is 10 – 2000 AU/mL.
Σ = 96 test
REF DKO123
2.
STORAGE AND PREPARATION OF TEST SERUM
SAMPLE
Sera to be analysed should be assayed soon after
separation or stored, preferably in aliquots, at or below –
20°C. 50 µL is sufficient for one assay (duplicate 25 µL
determinations). Repeated freeze thawing or increases in
storage temperature should be avoided. Do not use
lipaemic or haemolysed serum samples. EDTA plasma
may be used in the assay. When required, bring test sera
to room temperature and mix gently to ensure
homogeneity. Centrifuge sera prior to assay (preferably for
5 min at 10-15,000g in a microfuge) to remove particulate
matter. Please do not omit this centrifugation step if sera
are cloudy or contain particulates.
3. MATERIALS REQUIRED AND NOT SUPPLIED
Pipettes capable of dispensing 25 µL and 100 µL.
Means of measuring out various volumes to reconstitute or
dilute reagents.
Pure water.
ELISA Plate reader suitable for 96 well formats and
capable of measuring at 450 nm and 405 nm.
ELISA Plate shaker, capable of 500 shakes/min (not an
orbital shaker).
ELISA Plate cover.
4. PREPARATION OF THE REAGENTS SUPPLIED
Store unopened kit and reagents at 2-8°C.
1. Microplate
REF DCE002/12303-0
12 breakapart strips of 8 wells (96 in total) in a frame and
sealed in a foil bag.
Ensure stripwells are firmly fitted into frame provided. After
opening return any unused wells to the original foil packet
with desiccant provided and seal with adhesive tape. Place
foil bag in the self-seal plastic bag and store at 2-8°C for up
to 2 weeks.
2. Calibrators (5 vials, 0.7 mL each, ready to use)
CAL1
- 10 AU/mL
REF DCE002/12306-0
CAL2
- 20 AU/mL
REF DCE002/12307-0
CAL3
- 75 AU/mL
REF DCE002/12308-0
CAL4
- 500 AU/mL
REF DCE002/12309-0
CAL5
- 2000 AU/mL
REF DCE002/12310-0
(AU are Diametra arbitrary units)
3. Positive Controls (2 vials, 0.7 mL, ready to use)
See label for concentration range
REF DCE045/12304-0 and REF DCE045/12305-0
4. Negative Control (1 vial, 0.7 mL each, ready to use)
REF DCE045/12301-0
5. ZnT8 Biotin (3 vials, lyophilised)
REF DCE019/12319-0
Reconstitute each vial with 5.5 mL ZnT8 Biotin
reconstitution buffer (reagent 6). When more than one vial
is used, pool the vials and mix gently before use. Store at
2-8°C for up to 3 days after reconstitution.
6. ZnT8 Biotin buffer (2 vial, 15 mL each, red coloured,
ready to use)
REF DCE047/12347-0
7. 20X Streptavidin Peroxidase (SA-POD)
(1 vial, 0.7 mL, concentrated)
REF DCE041/12341-0
Dilute 1 in 20 with Diluent for SA-POD (reagent 8) before
use. For example, 0.5 mL (reagent 7) + 9.5 mL (reagent 8).
Store at 2-8°C for up to 16 weeks after dilution.
8. SA-POD diluent (1 vial, 15 mL, ready to use)
REF DCE048/12348-0
9. TMB Substrate (1 vial, 15 mL, ready to use)
REF DCE004/12304-0
10. 10X Conc. Wash Solution (1 vial, 125 mL)
REF DCE054/12354-0
Dilute 10X with pure water before use. For example, 100
mL (reagent 10) + 900 mL pure water. Store at 2-8°C for
up to kit expiry date.
11. Stop Solution (1 vial, 12 mL, ready to use)
REF DCE005/12305-0
5. ASSAY PROCEDURE
Allow all reagents to reach room temperature (22-28°C) on
day of use, except ZnT8 Biotin and ZnT8 Biotin
reconstitution buffer. A repeating Eppendorf type pipette is
recommended. Perform the assay in duplicate, for every
Calibrator, Control, Sample Serum and leave two wells
empty for Blanks.
Day 1
Reagent
Calibratore
CAL1-CAL5
Calibrator
Sample/
Controls
Blanks
25 µL
Control
25 µL
Sample
25 µL
Cover the frame, shake for approximately 5 seconds on a
plate shaker and incubate overnight, for 16-20 hours, at
2-8°C without shaking.
Day 2
Use an ELISA plate washer to aspirate and wash the
wells three times with diluted Wash Solution. If a plate
washer is not available, discard the well contents by
briskly inverting the frame of stripwells over a suitable
receptacle, wash three times manually and finally tap the
inverted wells gently on a clean dry absorbent surface.
Cold
Reconstituted
100 µL
100 µL
ZnT8 Biotin
Cover the plate, and incubate at 2-8°C for 1 hour without
shaking.
Use an ELISA plate washer to aspirate and wash the
wells three times with diluted Wash Solution. If a plate
washer is not available, discard the well contents by
briskly inverting the frame of stripwells over a suitable
receptacle, wash three times manually and finally tap the
inverted wells gently on a clean dry absorbent surface.
Diluted
SA-POD
100 µL
100 µL
Cover the plate and incubate at room temperature (2228°C) for 20 minutes on an ELISA plate shaker (500
shakes per min).
Use an ELISA plate washer to aspirate and wash the wells
three times with diluted Wash Solution. If a plate washer
is not available, discard the well contents by briskly
inverting the frame of stripwells over a suitable receptacle,
wash three times manually and finally tap the inverted
wells gently on a clean dry absorbent surface.
If manual washing is being carried out use one additional
wash step with pure water (to remove any foam) before
finally tapping the inverted wells dry.
TMB
Substrate
100 µL
100 µL
100 µL
Incubate in the dark at room temperature (22-28°C) for 20
minutes without shaking.
Stop
Solution
100 µL
100 µL
100 µL
Shake the plate for approximately 5 seconds on a plate
shaker. Ensure substrate incubations are the same for
each well.
Within 5 minutes, read the absorbance of each well at 405
nm, then at 450 nm, using an ELISA plate reader, blanked
against the wells containing 100 µL of TMB Substrate and
100 µL Stop Solution only.
6. RESULT ANALYSIS
A calibration curve can be established by plotting calibrator
concentration on the x-axis (log scale) against the
absorbance of the calibrators on the y-axis (linear scale).
The ZnT8 autoantibody concentrations in patient sera can
then be read off the calibration curve. Other data reduction
systems can be used. The negative control has a
concentration of 0 AU/mL, but can be assigned a value of 1
AU/mL to facilitate computer processing of data. Samples
with high ZnT8 Ab concentrations can be diluted in kit
negative control (reagent 4). For example, 15 µL of sample
plus 135 µL of negative control to give a 10x dilution. Other
dilutions (e.g. 100x) can be prepared from a 10x dilution or
otherwise as appropriate. Some sera will not dilute in a
linear way.
TYPICAL RESULTS (example only, not for calculation of
actual results)
Calibrator
CAL1
CAL2
CAL3
CAL4
CAL5
NEG Control
POS Control 1
POS Control 2
Absorbance
405 nm
450 nm
0.016
0.060
0.037
0.134
0.203
0.673
0.973
3.222
2.276
7.738
0.002
0.008
0.137
0.463
0.477
1.596
AU/mL
10
20
75
500
2000
0
60
134
Absorbance readings at 405 nm can be converted to 450 nm
absorbance values by multiplying by the appropriate factor
(3.4 in the case of equipment used at Diametra).
7.
ASSAY CUT OFF
Cut off
Negative
Positive
AU/mL
< 15 AU/mL
≥ 15 AU/mL
8. CLINICAL SPECIFICITY AND SENSITIVITY
In the DASP 2010 study the Diametra ZnT8 Ab ELISA kit
achieved 99% (n=90) specificity and 68% (n=50) sensitivity.
The data quoted in these instructions should be used for
guidance only. It is recommended that each laboratory
include its own panel of control samples in the assay. Each
laboratory should establish its own normal and pathological
reference ranges for ZnT8 autoantibody levels.
9.
SAFETY CONSIDERATION
This kit is intended for in vitro use by professional persons
only. Follow the instructions carefully. Observe expiry dates
stated on the labels and the specified stability for
reconstituted reagents. Refer to Materials Safety Data Sheet
for more detailed safety information. Material of human
origin used in the preparation of the kit has been tested and
found non reactive for HIV1 and 2 and HCV antibodies and
HBsAg but should, none-the-less, be handled as potentially
infectious. Wash hands thoroughly if contamination has
occurred and before leaving the laboratory. Sterilise all
potentially contaminated waste, including test specimens
before disposal. Material of animal origin used in the
preparation of the kit has been obtained from animals
certified as healthy but should be handled as potentially
infectious. Some components contain small quantities of
sodium azide as preservative. As with all kit components,
avoid ingestion, inhalation, injection or contact with skin,
eyes and clothing. Avoid formation of heavy metal azides in
the drainage system by flushing any kit component away
with copious amounts of water.
10. REFERENCES
• J. M. Wenzlau et al., “The cation efflux transporter ZnT8
(Slc30A8) is a major autoantigen in human type I
diabetes.” PNAS 2007 104:17040-17045
• P. Achenbach et al., “Autoantibodies to zinc transporter
8 and SLc30A8 genotype stratify type 1 diabetes risk.”
Diabetologia 2009 52:1881-1888
Manufactured under licence to European patent 1563071
and patents pending in other countries
Ed. 03/2012
DCM123-1
DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, 18 – 20090
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Manufactory: Via Pozzuolo 14, 06038 SPELLO (PG) Italy
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DCM123-1
Ed. 03/2012
ZnT8 Ab
para análisis de rutina
Inmunoensayo enzimatico para la cuantificación de ZnT8 (Zinc Transporter 8) en suero humano
LOT
IVD
Ver etiqueta externa
USO PREVISTO
El kit ELISA Diametra ZnT8 es para uso exclusivo en el
laboratorio, por profesionales capacitados, para la
determinación de los autos anticuerpos anti ZnT8 en el
suero humano. Los anticuerpos contra las células beta del
páncreas son importantes marcadores serológico para el
Diabetes Mellitus tipo 1. Los antígenos reconocidos por
estos anticuerpos incluyen: insulina, el acido glutamico
decarboxilasa (isoforma GAD65), el antígeno celular IA-2 o
ICA.512 y el trasportador de zinc ZnT8. Los anticuerpos
anti ZnT8 son dirigidos principalmente contra el dominio cterminal de la molécula (residuos 268-369). El
polimorfismo genético en la población humana en el codón
del aminoácido 325 lleva a la expresión de tres variantes
proteicas: Arginina (R) 325, triptófano (W) 325 y muy
raramente glutamina (R) 325. Los anticuerpos anti ZnT8
pueden ser especifico para la variante R 325 o W 325, o
pueden no ser especifico para el residuo 325. Sueros
positivos únicamente para el alelo Q son muy raros. El kit
ELISA Diametra ZnT8 puede detectar y cuantificas los auto
anticuerpos específicos para R 325 o W 325 y para
variantes no especificas del residuo 325.
1. PRINCIPIO DEL MÉTODO
En el kit ELISA Diametra ZnT8, los autoanticuerpos anti
ZnT8 presentes en las muestras, calibradores y controles,
interactúan con el ZnT8 adsorbido en los pocillos de la
placa. Después de 16-20 horas de incubación, los pozos
se lavan con la solución de lavado
dejando
autoanticuerpos ZnT8 unidos a los pocillos de
microtitulación revestidos con ZnT8. En la segunda etapa
de incubación se añade ZnT8 biótina; debido a la
capacidad de los auto anticuerpos anti ZnT8 de actuar de
forma bivalente, se forma un puente entre el ZnT8 ligado a
la placa y le ZnT8 biotilinado. La biótina no unida se
elimina posteriormente por una etapa de lavado, mientras
que la cantidad de biótina unida se determina en una
tercera etapa de incubación a través de la adición de
estreptavidina conjugada con peroxidasa (SA-POD). El
exceso de SA-POD no unida se elimina por lavado y la
posterior adición de 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)
conduce a la formación de un color azul. La reacción se
detiene con la adición de solución de parada, que produce
un cambio de color a amarillo. La absorbancia de la
solución de color amarillo se determina con un lector de
placas ELISA (405-450nm). Una alta absorbancia indica la
presencia de autoanticuerpos en la muestra ZnT8. La
lectura a 405 nm permite la cuantificación en absorbancias
altas. Los valores bajos (menor de 50 U/mL) debe ser
leídos a 450 nm. El rango de medición es 10-2000 AU/mL.
Σ = 96 test
REF DKO123
2. PREPARACIÓN
Y
CONDICIONES
DE
ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS
Las muestras deben analizarse a la brevedad después de
la extracción y centrifugación, si no se utilizan en el día de
extracción almacénelas en alícuotas a una temperatura
igual o inferior a -20°C. Cantidades de 50 µL son
suficientes para un ensayo en duplicado (25 µL por
determinación). Evítese repetidos ciclos de congelación y
descongelación.
No usar muestras hemolizadas o
lipemicas, plasma con EDTA puede utilizarse. Si se
requiere (muestras congeladas) lleve la muestra a
temperatura ambiente y mézclela para asegurar
homogeneidad. Centrifugue el suero a altas revoluciones
(10,000-15,000g) para sedimentar materia particulada, por
favor no se omita este paso si el suero es turbio o contiene
partículas.
3. MATERIALES REQUERIDOS NO PROVISTOS EN EL
KIT
Pipetas para dispensar volúmenes de 25-100 µL y las
necesarias para medir distintos volúmenes para la
reconstitución y dilución de los reactivos.
Agua pura destillada.
Lector de microplaca ELISA con filtros de 405 y 450nm
Agitador de placas ELISA, 500 revoluciones por minuto.
Cobertor de placas ELISA.
4. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS PROVISTOS
Almacenar el kit a 2-8°C.
1. Microplaca
REF DCE002/12303-0
Doce tiras de 8 pozos cada una (96 en total) rompibles con
soporte y empacadas en foil de aluminio.
Asegúrese que las tiras estén firmemente colocadas en su
soporte, las tiras no utilizadas deben reponerse en su
empaque original junto al sobre de desecante. Asegúrese
de cerrar cuidadosamente la bolsita utilizando un tape
adhesivo, coloque el empaque en una segunda bolsa
plástica y almacene a 2-8°C.
2. Calibradores (5 viales, 0.7mL cada uno. Listos para
el uso)
CAL1
- 10 AU/mL
REF DCE002/12306-0
CAL2
- 20 AU/mL
REF DCE002/12307-0
CAL3
- 75 AU/mL
REF DCE002/12308-0
CAL4
- 500 AU/mL
REF DCE002/12309-0
CAL5
- 2000 AU/mL
REF DCE002/12310-0
(AU= Unidades Arbitrarias)
3. Control Positivo (2 viales, 0.7mL cada uno, listos
para el uso)
La concentración es declarada en la etiqueta.
REF DCE045/12304-0 y REF DCE045/12305-0
4. Control Negativo (1 vial, 0.7mL, listo para el uso)
REF DCE045/12301-0
5. ZnT8 Biotina (3 viales liofilizados)
REF DCE019/12319-0
Reconstituir cada vial con 5.5 mL de ZnT8 Biotina Tampón
(Reactivo 6), mezcle cuidadosamente antes de usarse. La
solución es estable 3 días después de haberse
reconstituido, almacenar a 2-8°C.
6. ZnT8 Biotina Tampón (2 viales 15 mL cada uno,
color rojo, listo para el uso)
REF DCE047/12347-0
7. 20XStreptavidina peroxidasa (SA-POD)
(1 vial, 0.7mL concentrado)
REF DCE041/12341-0
Diluir 1 en 20 con el diluyente SA-POD (reactivo 8) antes
del uso. Ejemplo: 0.5mL (reactivo 7) + 9.5mL (reactivo 8).
Almacenar a 2-8°C durante un máximo de 16 semanas
después de la dilución.
8. SA-POD diluyente (1 vial, 15 mL, listo para el uso)
REF DCE048/12348-0
9. TMB Substrato (1 vial, 15 mL, listo para el uso)
REF DCE004/12304-0
10. 10X Solución de lavado concentrada (1 vial,
125 mL)
REF DCE054/12354-0
Diluir ante de usarse. Ejemplo: 100mL de Sol. De lavado
con 900mL de agua pura destilada. Almacenar a 2-8°C
hasta la fecha de expiración.
11. Solución de parada (1 frasco, 12 mL, listo para
usar)
REF DCE005/12305-0
DIA 1
Reactivo
Calibrad.
CAL1-CAL5
Muestra /
Controles
Blanco
25 µL
Control
25 µL
Muestra
25 µL
Cubra la placa con el apósito cobertor, mezcle durante 5
segundos en un agitador de placas e incube durante la
noche (16-20 horas) a temperatura ambiente 2-8°C sin
agitación.
DIA 2
Use un lavador de placas automático y lave los pozos
tres veces con la solución de lavado diluida. Si no
dispone de un lavador, entonces descarte el contenido
de los pozos con un movimiento brusco en un recipiente
adecuado, lave los pozos tres veces manualmente y de
ultimo golpee la placa contra un papel absorbente para
asegurarse de secar los pozos y no dejar residuos de
solución de lavado.
ZnT8 Biotina
(recién
reconstituida)
100 µL
100 µL
Cubra las placas e incube a 2-8°C durante 1 hora, sin
agitación. Después de la incubación lave como indicado
anteriormente.
SA-POD
diluida
5. PROCEDIMIENTO
Antes de usarse llevar todos los reactivos a temperatura
ambiente (22-28°C), con excepción de ZnT8-Biotina y
ZnT8 Biotina Tampón. Para el ensayo utilice pipetas
automáticas tipo Eppendorf, trabajar en duplicado, utilice
dos pozos para cada calibrador, control y muestra. Deje
dos pozos vacios para el blanco.
Calibrador
100 µL
100 µL
Cubra la microplaca y incube a temperatura ambiente
(22-28°C) durante 20 minutos en agitación (500
rev/min).
Después de la incubación lave como indicado
anteriormente. Nota: en este paso si ha aplicado el
procedimiento de lavado manual, lave una vez con agua
destilada para remover todo residuo de espuma.
TMB
Substrato
100 µL
100 µL
100 µL
Incubare al buio a temperatura ambiente (22-28°C) per
20 minuti senza agitazione.
Solucion de
parada
100 µL
100 µL
100 µL
Agite las placa durante 5 segundos en el agitador,
asegúrese que la incubación con el sustrato haya
durado el mismo tiempo para cada pozo.
Dentro de los primero 5 minutos leer la absorbancia de
los pozos a 405 y 450nm, usando un lector de placas
ELISA. Restar la absorbancia de los pozos Blanco.
6. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS
Establecer la curva de calibración asignando en el eje X
(escala logarítmica) el valor de concentración de los
calibradores y en el eje Y (escala linear) el valor de
absorbancia de los calibradores. La concentración de las
muestras se obtiene interpolando el valor obtenido en
absorbancia en la curva de calibración. Pueden aplicarse
otros sistemas de cálculo. Eel primer calibrador tiene un
valor igual a 0 AU/mL para facilitar el sistema de computo,
cuando se utiliza un software, puede asignarle un valor de
1 AU/mL. Muestras con valores elevados de ZnT8 pueden
diluirse con el estándar 0 AU/mL en razón de 1:10, para
diluciones mayores se recomienda hacer diluciones
seriadas. Tome en cuenta que no siempre las diluciones
son lineares.
Resultados Típicos (No utilice estos datos para el
cálculo de los resultados, se trata de un ejemplo)
Calibrador
CAL1
CAL2
CAL3
CAL4
CAL5
Control Negativo
Control Positivo 1
Control Positivo 2
Absorbancia
405 nm
450 nm
0.016
0.060
0.037
0.134
0.203
0.673
0.973
3.222
2.276
7.738
0.002
0.008
0.137
0.463
0.477
1.596
AU/mL
10
20
75
500
2000
0
60
134
La absorbancia leida a 405nm puede convertirse a 450nm
multiplicándola por el factor apropiado, en el caso del equipo
utilizado por Diametra f=3.4
7. ENSAYO CUALITATIVO CUT-OFF
Cut-off
Negativo
Positivo
AU/mL
< 15 AU/mL
≥ 15 AU/mL
8. ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD CLÍNICA
En el estudio efectuado en el 2010 por DIAMETRA (DASP)
el kit ZnT8 obtuvo una especificidad del 99% (n=90) y una
sensibilidad del 68% (n=50). Los datos publicados en este
folleto de instrucciones son indicativos, se recomienda que
cada laboratorio incluya su propio panel de sueros control en
cada corrida. Cada laboratorio debería establecer su propio
rango de valores normales.
9. CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD
Este kit es para uso en vitro y por personal capacitado, siga
cuidadosamente las instrucciones. Observe las fechas de
expiración
impresas en las etiquetas así como las
estabilidades declaradas para los reactivos reconstituidos.
Refiérase al MSDS para informaciones de seguridad más
detalladas, todo material de origen humano utilizado en el
kit ha sido ensayado y resultó negativo a las pruebas de
HIV1, HIV2, HCV (Anticuerpos) y de HBsAg. Aun así
maneje los componentes
de este equipo como
potencialmente infectocontagiosos. Algunos componentes
contienen pequeñas cantidades de Acide de Sodio como
conservante, evite la formación de metales pesados de
acide en los drenajes dejando fluir abundante cantidad de
agua. Evite la ingestión, inhalación o el contacto con la piel
u ojos.
10. BIBLIOGRAFÍA
• J. M. Wenzlau et al., “The cation efflux transporter ZnT8
(Slc30A8) is a major autoantigen in human type I
diabetes.” PNAS 2007 104:17040-17045
• P. Achenbach et al., “Autoantibodies to zinc transporter
8 and SLc30A8 genotype stratify type 1 diabetes risk.”
Diabetologia 2009 52:1881-1888
Producido bajo patente Europea N. 1563071, patente
pendiente en otros paises
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DiaMetra
IVD
yyyy-mm-dd
Σ = xx
Max
Min
Packaging Information Sheet
Mod. PIS000
DE
ES
FR
GB
IT
PT
In vitro Diagnostikum
Producto sanitario para diagnóstico In vitro
Dispositif medical de diagnostic in vitro
In vitro Diagnostic Medical Device
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Dispositivos medicos de diagnostico in vitro
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Hergestellt von
Elaborado por
Fabriqué par
Manufacturer
Produttore
Produzido por
DE
ES
GB
IT
Achtung, Begleitdokumente
Precaución, consulte los documentos adjuntos
Caution, consult accompanying documents
Attenzione, consultare la documentazione
allegata
PT
FR
Atenção,consultar os documentos de acompanhamento
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Herstellungs datum
Fecha de fabricacion
Date de fabrication
Date of manufacture
Data di produzione
Data de produção
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Verwendbar bis
Establa hasta (usar antes de último día del mes)
Utiliser avant (dernier jour du mois indiqué)
Use by (last day of the month)
Utilizzare prima del (ultimo giorno del mese)
Utilizar (antes ultimo dia do mês)
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Biogefährdung
Riesco biológico
Risque biologique
Biological risk
Rischio biologico
Risco biológico
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Gebrauchsanweisung beachten
Consultar las instrucciones
Consulter le mode d’emploi
Consult instructions for use
Consultare le istruzioni per l’uso
Consultar instruções para uso
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Chargenbezeichnung
Codigo de lote
Numero de lot
Batch code
Codice del lotto
Codigo do lote
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Ausreichend für “n” Tests
Contenido suficiente para ”n” tests
Contenu suffisant pour “n” tests
Contains sufficient for “n” tests
Contenuto sufficiente per “n” saggi
Contém o suficiente para “n” testes
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Inhalt
Contenido del estuche
Contenu du coffret
Contents of kit
Contenuto del kit
Conteúdo do kit
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Temperaturbereich
Límitaciôn de temperatura
Limites de température de conservation
Temperature limitation
Limiti di temperatura
Temperaturas limites de conservação
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Bestellnummer
Nûmero de catálogo
Réferéncès du catalogue
Catalogue number
Numero di Catalogo
Número do catálogo
yyyy-mm
Attention, veuillez consulter les documents
d'accompagnement
LOT
CONT
REF
DiaMetra
Packaging Information Sheet
Mod. PIS000
SUGGERIMENTI PER LA RISOLUZIONE DEI PROBLEMI/TROUBLESHOOTING
ERRORE CAUSE POSSIBILI/ SUGGERIMENTI
Nessuna reazione colorimetrica del saggio
- mancata dispensazione del coniugato
- contaminazione del coniugato e/o del Substrato
- errori nell’esecuzione del saggio (es. Dispensazione accidentale dei reagenti in sequenza errata o provenienti da
flaconi sbagliati, etc.)
Reazione troppo blanda (OD troppo basse)
- coniugato non idoneo (es. non proveniente dal kit originale)
- tempo di incubazione troppo breve, temperatura di incubazione troppa bassa
Reazione troppo intensa (OD troppo alte)
- coniugato non idoneo (es. non proveniente dal kit originale)
- tempo di incubazione troppo lungo, temperatura di incubazione troppa alta
- qualità scadente dell’acqua usata per la soluzione di lavaggio (basso grado di deionizzazione,)
- lavaggi insufficienti (coniugato non completamente rimosso)
Valori inspiegabilmente fuori scala
- contaminazione di pipette, puntali o contenitori- lavaggi insufficienti (coniugato non completamente rimosso)
CV% intrasaggio elevato
- reagenti e/o strip non portate a temperatura ambiente prima dell’uso
- il lavatore per micropiastre non lava correttamente (suggerimento: pulire la testa del lavatore)
CV% intersaggio elevato
- condizioni di incubazione non costanti (tempo o temperatura)
- controlli e campioni non dispensati allo stesso tempo (con gli stessi intervalli) (controllare la sequenza di
dispensazione)
- variabilità intrinseca degli operatori
ERROR POSSIBLE CAUSES / SUGGESTIONS
No colorimetric reaction
- no conjugate pipetted reaction after addition
- contamination of conjugates and/or of substrate
- errors in performing the assay procedure (e.g. accidental pipetting of reagents in a wrong sequence or from the
wrong vial, etc.)
Too low reaction (too low ODs)
- incorrect conjugate (e.g. not from original kit)
- incubation time too short, incubation temperature too low
Too high reaction (too high ODs)
- incorrect conjugate (e.g. not from original kit)
- incubation time too long, incubation temperature too high
- water quality for wash buffer insufficient (low grade of deionization)
- insufficient washing (conjugates not properly removed)
Unexplainable outliers
- contamination of pipettes, tips or containers
insufficient washing (conjugates not properly removed) too high within-run
- reagents and/or strips not pre-warmed to CV% Room Temperature prior to use
- plate washer is not washing correctly (suggestion: clean washer head)
too high between-run - incubation conditions not constant (time, CV % temperature)
- controls and samples not dispensed at the same time (with the same intervals) (check pipetting order)
- person-related variation
DiaMetra
Packaging Information Sheet
Mod. PIS000
ERROR / POSIBLES CAUSAS / SUGERENCIAS
No se produce ninguna reacción colorimétrica del ensayo
- no se ha dispensado el conjugado
- contaminación del conjugado y/o del substrato
- errores en la ejecución del ensayo (p. ej., dispensación accidental de los reactivos en orden incorrecto o
procedentes de frascos equivocados, etc.)
Reacción escasa (DO demasiado bajas)
- conjugado no idóneo (p. ej., no procedente del kit original)
- tiempo de incubación demasiado corto, temperatura de incubación demasiado baja
Reacción demasiado intensa (DO demasiado altas)
- conjugado no idóneo (p. ej., no procedente del kit original)
- tiempo de incubación demasiado largo, temperatura de incubación demasiado alta
- calidad escasa del agua usada para la solución de lavado (bajo grado de desionización)
- lavados insuficientes (el conjugado no se ha retirado completamente)
Valores inexplicablemente fuera de escala
- contaminación de pipetas, puntas o contenedores- lavados insuficientes (el conjugado no se ha retirado
completamente)
CV% intraensayo elevado
- los reactivos y/o tiras no se encontraban a temperatura ambiente antes del uso
- el lavador de microplacas no funciona correctamente (sugerencia: limpiar el cabezal del lavador)
CV% interensayo elevado
- condiciones de incubación no constantes (tiempo o temperatura)
- controles y muestras no dispensados al mismo tiempo (con los mismos intervalos) (controlar la secuencia de
dispensación)
- variación en función de los operadores
ERREUR CAUSES POSSIBLES / SUGGESTIONS
Aucune réaction colorimétrique de l'essai
- non distribution du conjugué
- contamination du conjugué et/ou du substrat
- erreurs dans l'exécution du dosage (par ex., distribution accidentelle des réactifs dans le mauvais ordre ou en
provenance des mauvais flacons, etc.)
Réaction trop faible (DO trop basse)
- conjugué non approprié (par ex., ne provenant pas du coffret original)
- temps d'incubation trop court, température d'incubation trop basse
Réaction trop intense (DO trop élevée)
- conjugué non approprié (par ex., ne provenant pas du coffret original)
- temps d'incubation trop long, température d'incubation trop élevée
- mauvaise qualité de l'eau utilisée pour la solution de lavage (bas degré de déionisation)
- lavages insuffisants (conjugué non entièrement éliminé)
Valeurs inexplicablement hors plage
- contamination des pipettes, embouts ou récipients - lavages insuffisants (conjugué non entièrement éliminé)
CV% intra-essai élevé
- les réactifs et/ou les bandes n'ont pas atteint la température ambiante avant usage
- le laveur de microplaques ne lave pas correctement (suggestion : nettoyer la tête du laveur)
CV% inter-essai élevé
- conditions d'incubation non constantes (temps ou température)
- contrôles et échantillons non distribués en même temps (avec les mêmes intervalles) (contrôler l'ordre de
distribution)
- variabilité intrinsèque des opérateurs

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