23/05/2014 Cristina Zennaro Telethon Foundation Dipartimento di Science Mediche, Chirurgiche e della Salute Università degli Studi di Trieste czennaro@units.it Di cosa parleremo oggi: Metodica alternativa alla sperimentazione animale Sperimentazione animale e patologie renale Lo studio della barriera di filtrazione glomerulare e la sperimentazione animale 1 23/05/2014 Perché la domanda? Che cosa vuol dire alternativa? Il ricercatore ha l’obbligo di ricercare possibili alternative alla sperimentazione animale e solo nei casi in cui non sia possibile ottenere dei risultati riconosciuti validi l’autorizzazione animali brevia a ad livello eseguire internazionale esperimenti autorizzazione degli ha sugli organi competenti Perché la domanda? Che cosa vuol dire alternativa? Direttive europee recepite dalla Legislazione italiana (1992 ; 2014) ⇒ prendono in considerazione la definizione delle 3R (Russel e Burch, 1959) per cui alternativa alla sperimentazione animale è qualsiasi procedura che : Replacement ⇒ rimpiazzi totalmente l’utilizzo di animali con tecniche in vitro; Reduction ⇒ riduce il numero di animali necessari ad eseguire un determinato saggio, pur ottenendo lo stesso livello d’informazione; Refinement ⇒ raffini un metodo per ridurre la sofferenza imposta all’animale durante l’esecuzione di un saggio; 2 23/05/2014 Absolute replacement ⇒ si riferisce a qualsiasi approccio o precedura che non usi animali. Relative replacement ⇒ si riferisce a procedure in cui animali con sistema nervoso molto sviluppato vengono sostituiti con altri a basso sviluppo neurologico Alternativo ≠ Sostitutivo Procedure alternative validate Nei saggi tossicologici In ambito cosmetico in cui c’è stata una restrizione all’utilizzo di animali 3 23/05/2014 Ricostruzione in vitro in 3D della pelle Cheratinociti in coltura Modello di epidermide Cheratinociti in coltura su collagene o su scaffold artificiali Fibroblasti in coltura Modello di derma Corrosione della pelle Assorbimento cutaneo Fotossicità Corrosione della pelle Sostituisce il test sulla pelle rasata del coniglio (sostituito inizialmente da lembi di cute di ratto); Epidermide differenziata su diversi tipi di collagene; Test MTT è un saggio colorimetrico standard per la misurazione dell'attività degli enzimi che riducono l'MTT a formazano, conferendo alla sostanza un colore blu/violaceo; Test LDH dosaggio lattatodeidrogenasi liberata nel medium 4 23/05/2014 Assorbimento cutaneo Per assorbimento cutaneo si intende il processo mediante il quale una sostanza trasportata dallo strato corneo attraverso l’epidermide ed il derma, fino a raggiungere il sistema circolatorio e quindi i diversi tessuti dell’organismo. La camera viene testata per la sua integrità precedentemente con metodi diversi (penetrazione di una molecola marcata, misura della resistenza elettrica o della perdita di acqua attraverso l’epidermide) Fotossicità Test di assunzione del rosso neutro da parte di fibroblasti di topo (Balb/c 3T3) Sostanza da testare Esposizione raggi visibili o UV Assunzione del Rosso neutro Protocollo presente nelle Direttive europee 5 23/05/2014 Ricostruzione in vitro in 3D della pelle Chau et al, Biofabrication 2013 Cheratinociti Cellule dendritiche Tessuto immucompetente Produzione di citochine Fibroblasti Scopo degli esperimenti che utilizzano la sperimentazione animale 64% della sperimentazione animale viene eseguita nella ricerca di base e nella ricerca e sviluppo della medicina umana, dentistica e veterinaria; 1,6 % della sperimentazione viene eseguita per istruzione e training; 8% per studi tossicologici e valutazione della sicurezza del prodotto; Report from commission to the council and the europeran parliament. Brussel, 5.11.2007 6 23/05/2014 % delle specie animali utilizzati nella sperimentazione animale Report from commission to the council and the europeran parliament. Brussel, 5.11.2007 Proporzioni degli animali utilizzati nello studio delle patologie Report from commission to the council and the europeran parliament. Brussel, 5.11.2007 Malattie multisistemiche o che interessano organi complessi come il cervello 7 23/05/2014 Lo studio delle patologie renali e la sperimentazione animale Fino al 1960 le patologie a livello renale erano mortali Gli esperimenti sulle pecore sono stati essenziali nello studio degli shunt venoso arterioso che permettono di collegare a lungo tempo i pazienti alle macchine di dialisi; i primi tentativi di dialisi sono stati eseguiti nel 1913 sul cane. L’identificazione dei meccanismi immunitari che sono alla base del rigetto del tessuto sono emersi da studi eseguiti su topi e porcellini d’india. I farmaci che sopprimo la reazione di rigetto sono stati sviluppati in animali da laboratorio. La possibilità di sopprimere la risposta immunitaria nel caso di trapianto tra non individui identici (gemelli omozigoti) è stato perfezionato nel cane prima del primo successo di trapianto nell’uomo ⇒ le proprietà immunosopressive della ciclosporina sono state studiate nel ratto ( oltre al rene è stato possibile quindi avere successo con altri trapianti d’organo- cuore, fegato); I meccanismi che causano l’ipertensione arteriosa sono stati eseguiti in numerosi modelli animali ed hanno permesso di sviluppare nuovi farmaci in grado di mantenere la pressione nei lavori di normalità; Lo sviluppo della litotripsia per l’eliminazione dei calcoli renali è stato eseguito nel cane; 8 23/05/2014 Numero estimato di animali utilizzati nella ricerca in campo renale I primati non umani non vengono utilizzati per motivazioni etiche, per invalidità statistica, per possibile trasmissione di infezioni all’uomo; I maiali hanno molte similitudini con l’uomo nella dimensione, nel metabolismo e dell’anatomia renale:vengono considerati potenziale sorgente di xenotrapianto nell’uomo; Le pecore vengono utilizzate per produrre antisieri; Il coniglio Alcuni ceppi sviluppano spontaneamente condizione di rene policistico; Studi sulla calcolosi; Modelli di ostruzione uretrale; Il ratto e il topo Topo e ratto sono i modelli più utilizzati nella sperimentazione animali nello studio delle patologie renali: Animali di piccole dimensioni; Molte analogie e similitudini con i meccanismi umani ; Non esiste trasmissione infezioni tra topo/ratto e uomo; 9 23/05/2014 Il topo Possibilità di produrre manipolazioni geniche creando modelli KO, di overespressione e modelli condizionali; Creazione di modelli di patologie umane ma non di malattie complesse. Ad esempio il KO per ormone relaxina, inibitore endogeno della produzione di collagene, sviluppo fibrosi, l’infusione di relaxina porta all’abrogazione della produzione di fibrosi; Alcune mutazioni spontanee portano a modelli specifici di patologie ad interessamento renale; ma sono i resistenti alle comune “manipolazioni” che portano ad un modello di patologia renale. Sono in effetti resistenti all’induzione di glomerulosclerosi , ai meccanismi metabolici e a quelli immunomediati Sono resistenti all’induzione del danno a livello renale Nel ratto il modello di “remnant kidney model” porta nel ratto a ipertensione, fibrosi interstiziale, proteinuria e morte uremica ⇒ ipertensione e danno a livello renale sono difficile da ottenere nel topo. Nel ratto l’infusione di angiotensina II provoca proteinuria, glomerulosclerosi, ipertrofia cardiaca e fibrosi. Nel topo deve essere associata a nefrectomia unilaterale, aumento apporto salino con l’acqua, amministrazione di mineral corticoidi per poter evidenziare un danno renale. Nel ratto l’induzione di un modello animale di glomerulosclerosi è dato dall’iniezione di alcune sostanze tossiche che si sono dimostrate essere delle specifiche tossine per la struttura glomerulare (ad esempio la PAN- puromycin aminonucleoside); nel topo l’induzione della glomerulosclerosi si ha solo con l’iniezione di adriamicina, alias doxorubicina potente antiblastico con effetti cardiotossici. 10 23/05/2014 Il ratto Il ratto è più sensibile all’induzione del danno renale; E’ più grande e quindi più gestibile nelle metodiche chirurgiche; E’ possibile misurare la pressione arteriosa; Si ottiene più materiale sperimentale e contemporaneamente avere molteplici variabili come l’RNA, l’espressione proteica,ecc ; Allora si utilizzano i ratti!!! Non è così sempliceLL. non è possibile avere ceppi di ratti geneticamente modificati come per i topi per non conoscenza di linee di cellule germinali competenti ; ⇒ si incominciano ad avere i ratti KO per individuazione delle ES (embryonic stem cells) e nuove metodologie i ceppi di topo sono normalmente ceppi inbred, cioè ceppi molto stabili geneticamente, che danno risposte uniformi ; i ratti sono derivati da ceppi outbred ⇒ la nomenclatura Wistar e Sprangue Dawley non distingue due ceppi con caratteristiche ben delineate ma sottoceppi con differenti caratteristiche 11 23/05/2014 La ricerca in cui non è possibile ottenere informazioni con procedure alternative alla sperimentazione animale ⇒ ⇒ Alternativa non vuol dire sostitutiva Ratto e topo sono i modelli più usati ma sono modelli imperfetti; Approccio ad una ricerca sperimentale: è necessario un modello animale? identificare il modello animale più adatto alla vostro scopo. è possibile affiancare o eseguire delle prove sperimentali in vitro prima dell’esecuzione degli esperimenti sull’animale? è possibile ottenere gli stessi risultati utilizzando un modello animale con sviluppo neurologico inferiore? Questo approccio richiede esperienza pluriennale ed un studio bibliografico approfondito Richiesta autorizzazione ministeriale (Dgl 24/03/2014 n. 26) 12 23/05/2014 Il nostro campo di ricerca: La barriera di filtrazione glomerulare Kidney Nephron Glomerulus podocytes I meccanismi di filtrazione glomerulare 13 23/05/2014 La barriera di filtrazione glomerulare Haraldsson et al, 2008 Cellula podocitaria Kerjaschki, 2001 14 23/05/2014 Struttura molto complessa Meccanismi intimi della struttura e l’apporto derivante dal circolo sanguineo E’ necessaria la sperimentazione animale ? Ci sono metodi alternativi? Modelli animali sperimentali di nefropatia in ratto Rene isolato e perfuso (Refinement) Savin e al, 1992 Il test delle permeabilità glomerulare all’albumina. Si utilizzano glomeruli isolati di ratto. Si può testare l’effetto di un mediatore direttamente sulla barriera di filtrazione glomerulare (Refinement) 15 23/05/2014 Test in vitro “Permeabilità glomerulare all’albumina in glomeruli isolati di ratto (Palb)” (Savin e al, 1992) ratti Sprague Dawley corticale renale setaccio ∆V 3-6 % 1 g/dl BSA 5 g/dl BSA polylisina Incubazione a 37° per 10 min con mediatore da testare Test in vitro “Permeabilità glomerulare all’albumina in glomeruli isolati di ratto (Palb)” (Savin e al, 1992) BSA 1% BSA 5% H2O Alb. H2O Alb. σalb = 1 H2O Alb. σalb = o Palb = (1- σalb) 16 23/05/2014 Glomerulo sano ∆V 3-6 % 5 g/dl BSA 1 g/dl BSA Palb≥0,5 La barriera glomerulare ha aumentato la sua permeabilità all’albumina DIAGNOSI DI FSGS Quadro istologico Aree di sclerosi, spesso con inclusioni ialine, che sostituiscono uno o più segmenti della massa glomerulare (lesione segmentaria) di un limitato numero di glomeruli (focale), mentre i glomeruli residui appaiono normali 17 23/05/2014 Fattori di permeabilità Increase of glomerular permeability Danno intrinseco (tossico) Danno estrinseco (risposta adattativa) actina D’Agati 2008 18 23/05/2014 Savin et al. Circulating factor associated with increased glomerular permeability to albumin in recurrent focal segmental glomerulosclerosis. N Eng J Med 334: 878-883, 1996. Dall’Amico et al. Prediction and treatment of recurrent focal segmental glomerulosclerosis after renal transplantation in children. Am J Kidney Dis 34: 1048-1055, 1999. I pazienti che presentano un valore di Palb alterato hanno una probabilità di recidiva dopo trapianto elevata rispetto a quelli con Palb negativa Putative Permeability factor • • • • Il test Palb ha permesso di capire che: Oxidative stress VEGF Hemopexin CLC-1 SuPAR Alteration of immune response Protease activity Il podocita è un cellula altamente differenziata (cellula in uno stadio post-mitotico) ⇒ non si divide Solo alla fine degli anni 90 si incomincia ad avere delle colture primarie da glomerulo isolato di ratto e umane che potevano essere identificate come tali; Problema identificazione: individuazione di specifici markers di podociti differenziati per identificale la coltura di interesse e specifici medium di coltura; Si ottengono colture di podociti differenziati ma non è possibile avere un numero adeguato di esperimenti per non divisione Immortomouse ⇒ Immortalizzazione con SV40 che in condizioni permissive (T=33° e IFNγ) si moltiplicano in condizioni non permissive e si differenziano in condizioni non permessive 19 23/05/2014 ⇒interazioni fra le componenti strutturali scoperte grazie alla sperimentazione nell’animale ; ⇒ confermare il ruolo centrale dei processi citoscheletrici nella risposta all’insulto; ⇒ dimostrare che il podocita è un componente della risposta immunitaria innata per la presenza B7-1, antigene presente sulla superficie delle cellule B e sulle cellule presentante l’antigene; Shankland et al, 2007 Coltura cellulare ≠ Struttura barriera di filtrazione glomerulare Keniaschki et al, 2001 Co-cultura cellule endoteliali-podociti E’ ancora importante eseguire la sperimentazione animale 20 23/05/2014 Zennaro C et al. 2013. Podocyte expression of membrane transporters involved in puromycin aminonucleoside-mediated injury. PLoS One. 20;8(6):e66159. 2013 Human immortalized podocyets Primary rat podocytes Refinment Isolated glomeruli Protocollo animale Reduction Non è possibile sostituire del tutto la sperimentazione animale con metodiche alternative. Replacement ???? Relative replacement ⇒ procedure in cui animali con sistema nervoso molto sviluppato vengono sostituiti con altri a basso sviluppo neurologico; Yes, the Zebrafish model Danio rerio 21 23/05/2014 The Zebrafish: life cycle and stage of embryonic development 0→ →5 dpf 3 mm hpf= hours post fertilization dpf= days post fertilization (pochi mm) I° WORKSHOP 22 23/05/2014 23 23/05/2014 Ceppo Fli 1 Lawson & Weinstein, 2002 24 23/05/2014 (b) (a) (c) NT NT ADR5 ADR5 ADR10 ADR10 ADR20 ADR20 ADR30 ADR30 ADR40 ADR40 Zennaro C ed al, 2014 Pronephric nephrons in Zebrafish embryos and larvae embryos 0 dpf larvae 3 dpf Pronephron (1 glomerulus) adult juvenile 30 dpf 90 dpf Mesonephron (+ glomeruli) 2 years 72-96 hpf (Drummond & Davidson, 2010) 25 23/05/2014 Kramer-Zucker et al, 2005 “ Pericardial edema formation in larval zebrafish after exposure to pharmacological agents or alteration of protein expression indicates possible glomerular patology” NT PAN 250 -350 mg/kg 2 dpf CD2AP MO podocin MO Hentschel el al, 2007 26 23/05/2014 Struttura glomerulare fluorescente Hi et al, 2011 Műller et al, 2011 Cosa ci portiamo a casa: ⇒L’ applicazione del postulato delle 3D è direttamente correlato all’evolversi della ricerca; ⇒Ad oggi però è ancora essenziale che le metodiche alternative siano sempre accompagnate da una sperimentazione animale adeguata; ⇒ A tal fine è importante individuare modelli animali con più basso sviluppo neurologico rispetto a quelli fino and ora utilizzati; 27 23/05/2014 Vi ringrazio per l’attenzione 28
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