CLC Genomics Workbench 7.0新機能と改良版マッピングプラグインのご紹介株式会社CLCバイオジャパンシニアフィールドバイオインフォマティクスサイエンティスト宮本真理 Ph.D mmiyamoto@clcbio.co.jp 1 アジェンダ • Genomics Workbench 概要 – 活用例 • Genomics Workbench 7.0 アップデート内容 • Mapping プラグインベータ版 • Microbial Genome Finishing Module によるPacBio対応 2 CLC Genomics Workbench • • • • • • 3 活用例病気の原因や関連遺伝子探索 • 自閉症の関連遺伝子を調べるため、ＮＧＳがスクリーニング的に利用され、 Genomics Workbench はマッピング、変異検出の１つの方法として利用された（3種類の異なる方法で2/3に見られる変異をその後の解析対象としている）。 • 候補となった遺伝子から2413個を使ったカスタムマイクロアレイが作成され、Ｃａｓｅ＝３０００人、Ｃｏｎｔｒｏｌ＝6000人のケースコントロールスタディが行われた • 11遺伝子がOdd ratio 1.5 で自閉症スペクトラムの子供に見つかった。 Matsunami N, Hensel CH, Baird L, Stevens J, Otterud B, Leppert T, Varvil T, Hadley D, Glessner JT, Pellegrino R, Kim C, Thomas K, Wang F, Otieno FG, Ho K, Christensen GB, Li D, Prekeris R, Lambert CG, Hakonarson H, Leppert MF: Identification of rare DNA sequence variants in high-risk autism families and their prevalence in a large case/control population. Mol Autism 2014, 5:5. 4 活用例 Matsunami N, Hensel CH, Baird L, Stevens J, Otterud B, Leppert T, Varvil T, Hadley D, Glessner JT, Pellegrino R, Kim C, Thomas K, Wang F, Otieno FG, Ho K, Christensen GB, Li D, Prekeris R, Lambert CG, Hakonarson H, Leppert MF: Identification of rare DNA sequence variants in high-risk autism families and their prevalence in a large case/control population. Mol Autism 2014, 5:5. 5 活用例 “Nontheless, variant calling using the three methods shown in Table 1 identified over one million sequence variants called by at least two of the three methods. Analysis using cSNP classifier resulted in the detection of 2,825 putative functional candidate SNPs, including 210 nonsense variants, 1,614 non- conservative missense variants, 35 frameshift variants and 966 splice site variants.” 3つの方法を使っても100万以上の変異は2/3の方法で変異とされていた。cSNPの分類により、2825の新規機能関連SNPsを見つけ、その中には、210のナンセンス変異、1614の非保存ミスセンス変異、35のフレームシフト変異と966のスプライスサイトでの変異があった。 Matsunami N, Hensel CH, Baird L, Stevens J, Otterud B, Leppert T, Varvil T, Hadley D, Glessner JT, Pellegrino R, Kim C, Thomas K, Wang F, Otieno FG, Ho K, Christensen GB, Li D, Prekeris R, Lambert CG, Hakonarson H, Leppert MF: Identification of rare DNA sequence variants in high-risk autism families and their prevalence in a large case/control population. Mol Autism 2014, 5:5. 6 Matsunami N, Hensel CH, Baird L, Stevens J, Otterud B, Leppert T, Varvil T, Hadley D, Glessner JT, Pellegrino R, Kim C, Thomas K, Wang F, Otieno FG, Ho K, Christensen GB, Li D, Prekeris R, Lambert CG, Hakonarson H, Leppert MF: Identification of rare DNA sequence variants in high-risk autism families and their prevalence in a large case/control population. Mol Autism 2014, 5:5. 7 活用例ゲノム未知の生物に対するトランスクリプトーム解析 • 五葉松のサビキンに対する感受性を調べるため、De novo トランスクリプトーム。 De novo アセンブリにてトランスクリプトを作成し、アノテーション。 • 未感染、感染し感受性を示したもの、感染し耐性を示したものについて発現差解析。Genomics Workbench はDe Novo アセンブリ、RNA-seq, 発現差解析で利用されている。 • 発現差があったものについてさらに機能解析を行っている。 Liu J-J, Sturrock RN, Benton R: Transcriptome analysis of Pinus monticola primary needles by RNA-seq provides novel insight into host resistance to Cronartium ribicola. BMC Genomics 2013, 14:884. 8 活用例 Liu J-J, Sturrock RN, Benton R: Transcriptome analysis of Pinus monticola primary needles by RNA-seq provides novel insight into host resistance to Cronartium ribicola. BMC Genomics 2013, 14:884. 9 活用例 Liu J-J, Sturrock RN, Benton R: Transcriptome analysis of Pinus monticola primary needles by RNA-seq provides novel insight into host resistance to Cronartium ribicola. BMC Genomics 2013, 14:884. 10 新バージョン 11 アップデート RNA-seq • ビューの大幅な改良 • 高速マッピング • 遺伝子間へのマッピングも可能に • EdgeRの搭載解析パイプライン • ワークフローツールの更なる改良系統樹解析 • 系統樹描画の機能拡張 12 RNA-seq ビュー改良 13 RNA-seq ビュー改良発現差＋変異も見やすい 14 発現解析： EdgeR搭載 • ＥｄｇｅＲは論文でもよく紹介されるカウントデータに対する発現差解析です。 • ＲＰＫＭのノーマライズ法は、発現差解析においては、十分ではないという指摘がありました。 • 7.0より、ＥｄｇｅＲに搭載されている内容と同じく、ノーマライズにはＴＭＭを使い、発現差解析はＥｘａｃｔＴｅｓｔを採用した発現差解析を行えるようになりました。 15 コンセンサス配列 • コンセンサス配列の作成の際、参照配列のアノテーションを付加させることが可能に。 16 系統樹ツール Workflow ツール改良より使いやすくなったワークフローツール Minimap Griｄ設定ビューモードの切り替えや、色の設定 18 ＤＥＭＯ 19 プラグインアップデート新マッピングプラグイン（ベータ版） 20 マッピングの詳細インデックスファイル作成スコア計算フィルタリング 21 マッピングの詳細 • インデックスファイルの作成 – ？インデックス Genome Read どこが似てるかな・・・？ Genomeの端から端まで順番に調べていては、膨大な時間がかかる 22 マッピングの詳細 • Genomeにインデックスと言う辞書の索引のようなものを作成し、検索効率を上げる。 Genome A Index AACGT… AAGGT… AATCT…. C CAATC… CAGGC… CGTTC…. G Read GAATC… GCACT… GCCGT… (※これはイメージで実際のSuffix array ではありません。) どこが似てるかな・・・？ 23 • Suffix Array T[i] A G T T C G $ Suffix i Suffix i AGTTCG$ 1 $ 7 GTTCG$ 2 AGTTCG$ 1 TTCG$ 3 CG$ 5 TCG$ 4 G$ 6 CG$ 5 GTTCG$ 2 G$ 6 TCG$ 4 $ 7 TTCG$ 3 Suffix Array, SA 24 Sort i 1 2 3 4 5 6 7 SA[i] 7 1 5 6 2 4 3 i 1 2 3 4 5 6 7 T[i] A G T T C G $ i 1 2 3 4 5 6 7 SA[i] 7 1 5 6 2 4 3 1 A C G G T T 2 G G $ T C T 3 T $ T G C 4 T C $ G 5 C G 6 G $ 7 $ $ $ もとの配列S と、Suffix Array, SAを使って高速に検索できる。 TGCAGACATTAGGAATTAAAAATTGAATCCATTGGACATGATGGTACCATGCTACCGAAACTTAAAACTCACTTTCAGAATTCCATCAGTGAT ATATGGGAGTAGTAATGTTGTCTAGGAATCATGAGTAATCACTACCCCAGTGGATACACTAAATAACCTGTAGCTGATCAATGTTTCTTGCCA GCCTTGACTTGCTTTCAAGTTGGTTTTTATCAACATTAACATCCTTCAACAGGAGGTCAACCCCAGAGGGAGATCCAAGCCACTTTCTGCTAG CTTCACTTGTGATGAACTTTTTACCATGTGATCATTTATTCT………………………………………………………………….GAAGGATGTATAAATGCTGA GGGCAGATAAAAACAACAAAAACCTTATTCCCCCTTTTCTAACCAGAATCCTTTTTTTCTTACACAACTCTCATATGAATCATTTGGAGAGAAT TTAGAAATAAAGATTAAAATCACTTTTCAATGTGTCCCTTTTACTGCCTGTAACTTCAACTAGCAGGTTTGAAGTTAGAGCCCTGTAATTTCTG TGGAGATTGACAAAGGCTACTTACCTTAATCTCCTGCTATCTTATGATGGGGTGCTGAATAGTATCTCACCTAAAAGGAGCTCAGGCAGGTC AGCAAAAATAGGAAAGTGTCATAGACTTAAGATAGGTAAATGATTTGTTGTTGGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTTG TTTTTCGAGACA$ SA = {3,009,821,212 3,009,821,210, ……………………………………………………………………………………………………………………………………..} GGATGTATAAA TGCAGACATTAGGAATTAAAAATTGAATCCATTGGACATGATGGTACCATGCTACCGAAACTTAAAACTCACTTTCAGAATTCCATCAGTGAT ATATGGGAGTAGTAATGTTGTCTAGGAATCATGAGTAATCACTACCCCAGTGGATACACTAAATAACCTGTAGCTGATCAATGTTTCTTGCCA GCCTTGACTTGCTTTCAAGTTGGTTTTTATCAACATTAACATCCTTCAACAGGAGGTCAACCCCAGAGGGAGATCCAAGCCACTTTCTGCTAG CTTCACTTGTGATGAACTTTTTACCATGTGATCATTTATTCT………………………………………………………………….GAAGGATGTATAAATGCTGA GGGCAGATAAAAACAACAAAAACCTTATTCCCCCTTTTCTAACCAGAATCCTTTTTTTCTTACACAACTCTCATATGAATCATTTGGAGAGAAT TTAGAAATAAAGATTAAAATCACTTTTCAATGTGTCCCTTTTACTGCCTGTAACTTCAACTAGCAGGTTTGAAGTTAGAGCCCTGTAATTTCTG TGGAGATTGACAAAGGCTACTTACCTTAATCTCCTGCTATCTTATGATGGGGTGCTGAATAGTATCTCACCTAAAAGGAGCTCAGGCAGGTC AGCAAAAATAGGAAAGTGTCATAGACTTAAGATAGGTAAATGATTTGTTGTTGGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTTG TTTTTCGAGACA$ 26 マッピングの詳細 • インデックスから、似ている場所の候補をいくつか選び、ミスマッチやGap を考慮してアライメントスコアを計算。まとめると Genome Index あそことあそこだよ Read 27 マッピングの詳細：問題点 • 実はSuffix Array は非常にメモリ空間を使う。おおよそゲノムサイズｘ5倍 +αがこれまでは最低必要でした（ヒトゲノム 3Gb の場合、24Gbのメモリ） Genome Index ・・・・out of memory・・・ 28 新プラグイン • Suffix Array をBW変換という方法を使って圧縮しやすい形へ変換して圧縮。小さなメモリでも大きなゲノムを扱えるように工夫。ヒトゲノムは８ＧＢ程度のメモリを持つコンピュータでマッピング可能に。 Genome Index ヒトゲノムなら8GBのコンピュータでOKだよ。 29 BW変換（Burrow Wheeler Transform） AGTTCG$ $AGTTCG G $ G$ GTTCG$A AGTTCG$ $ A $A TTCG$AG CG$AGTT T C TC TCG$AGT G$AGTTC C G CG CG$AGTT GTTCG$A A G$AGTTC TCG$AGT T T TT $AGTTCG TTCG$AG G T GT Sort Sort G 連結これがBW変換後の配列 B=[“G$TCATG”] BW変換後は圧縮しやすい形になり、かつ復元できるのが特徴 AG これは元の文字列の連続する2文字の組み合わせ。これから元の文字列が復元できる。 30 ベンチマーク：精度 • ベンチマークのIlluminaデータの中から100,000 リードを抽出。 • マッピングはSingle endモードで実施。 • アライメントスコアをMatch = +1, Mismatch = -2, Gap/deletion = -3 として計算し、アライメントスコア/リードの長さ x 100 としてスコア化 • 精度の比較として、Smith-Waterman アルゴリズムの結果と、それぞれのアルゴリズムを比較。 31 ベンチマーク：精度 32 補足 • プラグインの正式リリースは夏の予定。それまでにスピード・精度を他アルゴリズムと比較したホワイトペーパーをリリース予定。 • 現行バージョンのホワイトペーパーは以下よりダウンロード可能。 • ベータ版のアルゴリズムは、Genomics Workbench 7.0 のプラグインとしてすでに利用可能。 33 プラグインアップデートＭｉｃｒｏｂｉａｌＧｅｎｏｍｅＦｉｎｉｓｈｉｎｇＭｏｄｕｌｅ 34 Microbial Genome Finishing Module 概要 • Create Primers：プライマー設計のためのツール • Extend Contigs:コンティグにリードをマッピングし、その結果からコンティグを伸長させる。 • Find Sequence：目的の配列を検索するツール。 • Join Contigs：コンティグ同士の連結 • Reassemble Regions:コンティグについて指定した領域を再アセンブリする。 • Remove Extension of Contigs：Extend Contigs にて伸長した部分を削除する。 • Sample Reads:リードが多すぎるような場合に指定した量を取り出すツール 35 ＰａｃＢｉｏ対応 • Microbial Genome Finishing Module • エラーコレクション済みのＰａｃＢｉｏリードをＳｃａｆｆｏｌｄように利用可能 36 まとめ • Genomics Workbench 7.0までは変異解析のツールを充実させることに開発の重点が置かれていましたが、今後は変異解析やChIP-seqなどの開発に重点を置き、さらに使いやすく有用な製品開発を行います。 • 解析のスピードと精度向上のためのアルゴリズム改良も引き続き行っていきます。 • お客さまからのフィードバックもお待ちしております。 37 ご清聴ありがとうございました。 38