MAPキナ－ゼTNNI3Kを用いた新しい心疾患診断薬の展開研究と開発研究責任者：頼仲方一（熊本大学生命科学研究部医学系生体機能薬理学分野助教）コーディネーター：荒木寛幸（熊本大学マーケティング推進部研究コーディネーター）研究背景１ 1. TNNI3Kは心筋特異的に発現し、心筋トロポニンI（cTnI）と相互作用するMAP キナーゼである。 2. TNNI3K高発現はcTnIのリン酸化抑制による、自発活動電位第４相の自動脱分極速度の促進で心筋細胞の自発拍動頻度や収縮力を増強させる。その TNNI3K高発現心筋前駆細胞をラットやマウスの梗塞心筋局所へ移植すると心筋細胞再生の促進、梗塞面積の減少、左心室リモデリングの改善が示唆された。 3. 抗TNNI3Kポリクローナル抗体を用いた、心筋梗塞を中心とした心疾患で TNNI3K血中レベルを測定するELISA測定系を確立した。 4. 参考論文 Lai ZF：Am. J. Physiol. Heart and Circ Physiol. 2008; Lai ZF. Recent Patents Cardiovasc Drug Discovery. 2009 Lai ZF : (Symposium) AHA Scientific Sessions 2010, Chicago. Lai ZF: (Editorial) )World J Hypertension. 2012 研究背景２抗TNNI3Kポリおよびモノクローナル抗体を用いた、TNNI3Kが心筋虚血、心筋梗塞など心疾患におけるユニークな病態マーカーとして利用できるような診断薬を開発と確立し、心筋梗塞を中心とした心疾患でTNNI3K血中レベルを測定し既存のマーカーである cTnIとの比較解析を行った。抗TNNI3K抗体の作成モノポリ 4.0 コンビナント蛋白を作製し、TNNI3Kの全長リ 3.5 Absorbance (405 nm) 各種TNNI3K (全長、N-末端、C-末端)リコンビナント蛋白を用いて、抗TNNI3Kポリおよびモノクローナル抗体を作成した。 TNNI3K測定キットを利用して、健常者血清と急性心筋梗塞(AMI)患者血清および急性腎不全や慢性心不全歴のある患者の血液標本を検体として、TNNI3K の血中レベいという結果を得た。 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ルを測定した。その結果、AMI患者の血中 TNNI3K濃度は健常志願者より十倍以上高 3.0 0 0 20 40 60 80 100 120 TNNI3K concentrations (ng/ml) TNNI3K concentrations (ng/ml) 抗TNNI3Kポリおよびモノクローナル抗体を用いた、異なる濃度のTNNI3K抗原投与後の反応曲線 2010年AHA米国心臓学会年会口頭発表； 2010年日韓薬理学会合同セミナーfree topics講演； 2011年熊本大学総合技術研究会口演発表；論文も投稿中。抗TNNI3K抗体を用いた血中TNNI3K濃度の測定 B 2500(ng/ml) 500 血中TNNI3K濃度 (M±SD) A △TNNI3K 濃度(ng/ml) 400 300 200 TNNI3K (n=6) 100 1500 98 1000 (ng/ml) 2500 48 218.3±16.8 * 500 56 100 105 100 * 2000 # 80 TNNI3K cTnI 1500 40 1000 # 500 0 356.7±18.1 227.4±22.1 D 66 * * 40 6 急性腎不全 ROC 曲線血中TNNI3K濃度 (M±SD) C 12 24 36 虚血開始経過時間(h) ＃ 2000 0 0 0 2018.2±211.3 60 AMI patients (n=98) 40 20 0 急性心筋梗塞 0 20 40 60 特異性 80 100 研究開発成果 MAPキナ－ゼTNNI3Kを用いた新しい心疾患診断薬の特徴感受性が高い：血中TNNI3K濃度は急性心筋梗塞患者の方が健常者の方より十倍以上高かった特異性が高い：血中TNNI3K濃度の変化とcTnI濃度の変化を比べると、TNNI3Kは、ＡＭＩ患者の血清のみ上昇するが、cTnIの場合ではＡＭＩ患者のみならず、急性腎不全患者の血液サンプルにも見られた。早期確診薬として利用可能：血中TNNI3K濃度は虚血開始2時間後から上昇、12時間後にピークを迎え、48時間後でも同様な高いレベルに維持している。新技術の特徴、従来技術・競合技術との比較新規性：TNNI3Kは心筋に特異的に発現している新規MAPキナーゼであり、逸脱酵素として現在用いられている各種の心筋細胞傷害マーカー分子では捉えられない心筋の再生および収縮力についての情報を与える新規病態マーカーとなることが期待される。優位性：TNNI3Kは細胞質及び細胞核内に局在し、心筋虚血や心筋梗塞で細胞死やアポトーシスなど心筋傷害により細胞外に逸脱する可能性がある。TNNI3K を用いた新しい心疾患診断薬については特異性及び感受性が高い。濃度の上昇について心筋細胞 TNNI3K クレアチンキナーゼMB ミオグロビントロポニンI トロポニンT 虚血開始2時間後から上昇、12時間後にピークを迎え、 48時間後でも同様な高いレベルに維持している。心筋梗塞発症後 3～8時間から認められ、10～24 時間でピークを迎える。早期に消失する上昇は心筋梗塞発症後2～3時間から認められ、6 ～9時間で最大となり、18～24 時間で消失する 4時間から検出され、約14時間でピークとなる。その後、75～140 時間検出可能 4時間から検出され、約14時間でピークとなる。 2相性の上昇を示し約10日間検出可能非常に特異的特異性が高い特異的でない相対特異的相対特異的想定される用途抗TNNI3K抗体（ポリ、およびモノクローナル抗体）を用いて、健常者血清と急性心筋梗塞患者血清を検体としてTNNI3Kの血中濃度を測定する。 • 本技術の特徴を生かすためには、ELISAキットなどを製造することで心疾患診断試薬とするメリットが大きいと考えられる。 • 上記以外に、創薬の新規ターゲットとしての開発の効果が得られることも期待される。実用化に向けた課題実現性：本研究遂行に必要な各種材料と技術をほぼ準備済みである。今後必要なことはリコンビナント蛋白を用いたポリクローナル及びモノクローナル抗体の作製、これらを用いたELISA測定系の確立および患者血中TNNI3Kレベルの測定である。市場性：本邦の心筋梗塞を含む心疾患で死亡した患者は死亡率の第二位を占める。これを標的とした新規病態マーカーを用いた診断薬の開発は充分な市場性を有する。本技術に関する知的財産権 • 発明の名称：ＭＡＰキナーゼＴＮＮＩ３Ｋを用いた心疾患治療剤 • 出願番号 • 国際出願番号：特願２００６－５４７８１２：ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０２１５３５ • 出願人 • 発明者：熊本大学：頼仲方一、丁金鳳、孟憲敏想定される技術移転 ● 診断・試薬企業 ELISAキットの開発、診断薬の開発 ● 創薬企業治療剤の開発抗TNNI3Kポリクローナル抗体を樹立しており、この抗体を用いることで心筋虚血や心筋梗塞の早期診断を行うことが可能である。そこで、診断薬開発メーカーなどと連携し診断キットが開発できれば、心疾患の迅速な診断が可能になるものと期待できる。また、創薬メーカーと提携することで、この抗体を用いた新規ターゲットの治療剤の開発につなげたい。お問い合わせ先熊本大学マーケティング推進部研究コーディネーター（URA）荒木寛幸住所 E-mail TEL FAX ：〒860-8555 熊本市黒髪2丁目39番1号：hi-araki@jimu.kumamoto-u.ac.jp ：096-342-3148 ：096-342-3149