RNAガイド本文 01.1.22 3:46 PM ページ26 RNA Applications Guide 第6章 cDNA合成 cDNA合成の概説 AATTCCGTTGCTGTCG GGCAACGACAGC P mRNAに対応するcDNAライブラリーの構築は、分子生物学 において従来からかなりの困難を伴う実験手法の一つでした。 この手法ではmRNAを2本鎖cDNAに逆転写し、続いてベクター にライゲーションするための末端処理を含む、複雑な酵素反応 が行なわれます。cDNAライブラリーは下記のような様々なア プリケーションで有用です(1)。 P cDNA P T4 DNA Ligase 15℃, 4時間からO/N 遺伝子構造解析 タンパク質発現 ● DNAマッピング ● ● cDNA Universal RiboClone® cDNA Synthesis Systemは、Gublerお よびHoffmanにより改良された(3) OkayamaおよびBerg(2)によ る手法に基づいています。この手法は簡単に述べると、ランダ ムヘキサマーまたはoligo(dT)プライマーを用いてAMV逆転写酵 素による第1鎖合成を行い、続いてRNase HとDNA polymerase Iを用いた第2鎖の合成（置き換え）を行ないます。T4 DNA Polymeraseで平滑末端にし、EcoR Iアダプターのライゲーショ ンにより(図6-1) cDNA分子のクローニングへの準備が整いま す。その後cDNA-EcoR Iアダプター分子はLambda gt10や Lambda gt11などのベクターにクローニングされるというもの です(図6-2)。本システムには、cDNA合成やライゲーション反 応の効率を確認するために使用する、陽性コントロールRNAが 含まれます。 m7Gppp AAAA 第一鎖合成 42°C, 60 分間 m7Gppp Oligo(dT) Primer AMV Reverse Transcriptase First-Strand Buffer AAAA TTTT 第一鎖合成 14°C, 2時間 m7Gppp RNase H DNA Polymerase I Second-Strand Buffer AAAA TTTT 末端の平滑化 37°C, 10分間 AAAA TTTT T4 DNA Polymerase dNTPs AAAA TTTT 図6-1.Universal RiboClone® cDNA Synthesis Systemとoligo(dT)プラ イマーを使ったcDNA合成 26 70℃, 10 分間 T4 Polynucleotide Kinase 37℃, 30 分間 P cDNA P フェノール：クロロホルム抽出 スピンカラムクロマトグラフィー ベクター アーム ベクター アーム P cDNA P 脱リン酸化したベクターアーム T4 DNA Ligase 室温, 3 時間 cDNA 図6-2. 一般的なEcoR I アダプターライゲーションの概要 cDNA合成の典型的な方法では、mRNAからの第1鎖cDNAの 合成を開始するためにoligo(dT)プライマーを使用します。ラン ダムヘキサマープライマーにより、mRNAの内部から第一鎖 cDNAの合成を開始するという変法が提供されました（4）。ラ ンダムプライマーは原核生物のmRNAや一部のウイルスRNAな ど、ポリアデニル化されていないmRNA分子からの合成開始に 有用です。これらのプライマーを用いて生成されたcDNA産物 はランダムな方向にクローニングされます。 方向性のあるcDNAのクローニングは、ある種のアプリケー ションでは有効です。こうしたcDNAクローニングの手法は、 適切な発現ベクターにおいてインサートを正しいポリペプチド として発現する確率が2倍になります。 合成されたcDNA分子のほとんどは、mRNAの5'末端部分に相 補的な数ヌクレオチドを欠いています。これは第2鎖への置き 換えが3'-OH RNAプライマーから進行するためです。これらの プライマーは、添加されたRNase HおよびAMV逆転写酵素に既 存のRNase H活性によりランダムに生成されます。mRNAの最 も5'側のニックは、通常末端から数ヌクレオチドのところに生 じ、残りのRNAオリゴヌクレオチドはハイブリダイズした状態 を 保 つ に は 短 す ぎ る 可 能 性 が あ り ま す 。 そ の た め 、 DNA polymerase Iの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性がcDNA第1鎖の最 後の数ヌクレオチドを除去してしまいます。しかしすべての真 核生物のmRNA分子では、5'側に通常40∼80ヌクレオチドから 成る非翻訳リーダー配列が見られるため、ほとんどの2本鎖 cDNAには最初の細胞内mRNA分子に存在するコーディング配 列が含まれていると考えられます(4)。 RNAガイド本文 01.1.22 3:46 PM ページ27 Chapter 6 cDNA合成 逆転写酵素 M-MLV, RNase H (-) 逆転写酵素 逆 転 写 酵 素 (RT)は 、 RNAテ ン プ レ ー ト か ら 相 補 的 な DNA(cDNA)合成を触媒するDNAポリメラーゼの一種です(5-7)。 RNAからcDNAコピーを作製する逆転写酵素の活性は、cDNA ライブラリーの構築、RT-PCR(a)、プライマー・エクステンショ ンやRNAシークエンシングを含む多くの異なる分子生物学のア プリケーションで利用されています。 AMV RTとM-MLV RTは、両方とも2つの主要な活性を持ちま す。ひとつはRNA依存性DNAポリメラーゼ活性、もうひとつは RNase H活性です。DNAポリメラーゼ活性は、cDNA合成を必 要とする全てのアプリケーションで必要です。それに対し、 RNase H活性は完全長cDNAを合成するこの酵素の活性として 望ましくなく、むしろ妨げとなります。逆転写酵素は、DNAテ ンプレートとRNA:DNAハイブリッドにおいてDNA依存性DNA ポリメラーゼ活性も持つことに注意してください。しかし、こ の活性は大きくなく、一般的に分子生物学のアプリケーション で活用されることはありません。 RNase H(-)の逆転写酵素は特にcDNAライブラリー作製にお いて選択すべき酵素です。この酵素により長いテンプレートか ら完全長のcDNAを合成できるということは、作製したcDNAラ イブラリーがより正確にRNAプール（ライブラリーを作製する ために用いられる長短の転写産物）を反映しているということ です。その一方で、RNase H(-)の逆転写酵素を使用する一番の 利点が長鎖cDNAを合成することであるため、必要とされる DNAが通常短いRT-PCRや、プライマー・エクステンションの 結果改善には結びつかないかもしれません。長鎖cDNA (>5kb) が必要とされるアプリケーションには、RNase H (-)の逆転写酵 素をお使いいただくことを推奨します。RNAテンプレートの長 さのほかに、RNAテンプレート中で複雑な二次構造をとる領域 も、逆転写酵素が完全長cDNAを合成する能力に影響します。 反応温度を上げてcDNA合成反応を実施することで、問題とな る二次構造を持つ領域をリラックスさせ、合成反応を向上させ ることができます。RNAテンプレート中の二次構造が完全長 cDNAの合成を阻んでいる可能性がある状況下や、cDNA合成反 応 を 温 度 を 上 げ て 行 な い た い 場 合 、 M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutantを使用することを お薦めします。 RNase H活性とは RNase H 活性は、cDNA合成にもっとも適した逆転写酵素を 選ぶ際に重要な活性です。大腸菌のRNase H活性のように逆転 写酵素のRNase活性はRNA:DNAハイブリッドのRNA鎖を分解 します。cDNAが合成されると、逆転写酵素のRNase H活性の 基質となるRNA:DNAハイブリッドが形成されます。cDNA合成 におけるRNase H活性の影響は2つあります。完全長の逆転写 産物の全収量とパーセント収量が低下するということです。逆 転写反応は、RNAテンプレート中の特異的な配列にハイブリダ イズしたDNAプライマー、多くの場合poly(A)+ テールから開始 されます。プライマーとRNAのハイブリッドは重合のプライム サイト(開始点)として働くのみならず、逆転写酵素のRNase H 活性の基質にもなります。合成されるcDNAの収量は、逆転写 酵素が重合を開始する前にRNA:DNAハイブリッドを破壊する RNase H活性がどのくらいあるかにも影響されます。アプリケ ーションによってはcDNA合成を検出するためにRNAの最少量 を増加させる必要が生じます。さらに、この酵素のRNase H活 性により、DNA重合が起こっているサイトの近くのRNA鎖が切 断されることもあります。切断が起こるとRNA分子のコピーさ れていない部位が逆転写複合体から解離し、cDNA合成は停止 します。RNA分子が長ければ長いほどこのような現象は起こり やすくなります。その結果、お使いになる逆転写酵素にRNase H活性がある場合、長鎖RNA分子(>5kb)が完全にcDNAにコピ ーされにくくなります。 M-MLV RT, RNase H (-)の欠失変異型(deletion mutant) と点変異型(point mutant)の違い ほとんどのアプリケーションでは、M-MLV RTのどちらの RNase H (-)型もお使いいただけます。我々の観察では、点変異 型のほうが欠失変異型よりも高温での安定性があります。 1.2kbの鋳型を用いたcDNA合成反応において、M-MLV RT, RNase H Minus, Point Mutantを使った場合55℃まで完全長の cDNAが合成されるのを観察しました。同じ鋳型でM-MLV RT, RNase H Minus, Deletion Mutantを使った場合、50℃まで完全 長cDNAが合成されました。これらの酵素を高温で使う場合の 詳しい情報については、プロメガテクニカルサービスにお問い 合わせください。 (prometec@jp.promega.com) 逆転写酵素の比較には表6-1を参照ください。 27 RNAガイド本文 01.1.22 3:46 PM ページ28 RNA Applications Guide 表6-1．プロメガ逆転写酵素の特徴 AMV Reverse Transcriptase 推奨されるアプリケーション One-Step RT-PCR ○ Two-Step RT-PCR ○ cDNA合成（＜6kb） ○ cDNA合成（＞6kb） △ プライマーエクステンション ○ 酵素サイズ (kDa) 65kDaと94kDaの 12つのサブユニット 1からなるヘテロダイマー 原料 トリ骨芽腫ウィルス 粒子から精製 RNase活性 あり 熱による不活化 可能、70℃で15分間 (8) 熱安定性 42-58℃ (10) 至適pH 8.3、Tris-HCl中で 25℃で プロセッシビティ 97ヌクレオチド (14) （テンプレートから 外れるまでの平均 付加塩基数） 重合速度 テンプレートに依存 (文献17を参照) 要求性 DNAプライマー、 6-10mM Mg2+ または Mn2+ (19) デオキシヌクレオチド 2-40µM （テンプレートに依存） (19,20) エラー率 平均で2,000塩基中に1 (21) ｃDNAの大きさ 5kbまで 推奨するバッファー 50mM Tris-HCl (pH8.3), 条件 50mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 0.5mM spermidine 阻害剤 グリセロール (>10%), ribonucleotide vanadyl complexes (2mM), 比較表については 文献19を参照 推奨するRIラベル [α-32P]dATP または [α-35S]dATP (24) 基質となるヌクレオチド dNTP, DINTP, ddNTP, 7-deaza-dGTP,ビオチン またはdigoxigenin-11-dUTP およびfluorescein-12-dUTP (19) M-MLV Reverse Transcriptase (RNase H Plus) M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus Deletion Mutant × ○ ○ △ ○ M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant × ○ ○ ○ ○ × ○ ○ ○ ○ 71kDa 56kDa 71kDa 大腸菌のクローン 大腸菌のクローン 大腸菌のクローン あり 可能、70℃で15分間 (9) 37-42℃ (11) 8.0、Tris-HCl中で 37℃で (13) テンプレートに依存 (文献15,16を参照) なし 可能、70℃で15分間 (9) 40-50℃ (11) 8.0、Tris-HCl中で 37℃で (13) テンプレートに依存 (文献15,16を参照) なし 可能、70℃で15分間 (9) 37-55℃ (11) 8.0、Tris-HCl中で 37℃で (13) テンプレートに依存 (文献15,16を参照) 700塩基/分 (18) ND ND DNAプライマー、 1-2mM Mn2+ または 1-10mM Mg2+ (19) dATPには24µM、 dCTPには31µM(19) DNAプライマー、 1-2mM Mn2+ または 1-10mM Mg2+ (19) dATPには24µM、 dCTPには31µM(19) DNAプライマー、 1-2mM Mn2+ または 1-10mM Mg2+ (19) dATPには24µM、 dCTPには31µM(19) 平均で1,000塩基中に1 (22,23) 5kbまで 50mM Tris-HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mM DTT (13) 平均で1,000塩基中に1 (22,23) 6kbまで 50mM Tris-HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mM DTT (13) 平均で1,000塩基中に1 (22,23) 7.5kbまたはそれ以上 50mM Tris-HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mM DTT (13) ピロリン酸化ナトリウム, spermidine-HCl, グリセロール, ホルムアミド, SDS, ヘパリン, 比較表に ついては文献19を参照 [α-32P]dATP または [α-35S]dATP (24) dNTP, DINTP, 7-deaza-dGTP, ビオチン またはdigoxigenin-11-dUTP およびfluorescein-12-dUTP (19) ピロリン酸化ナトリウム, spermidine-HCl, グリセロール, ホルムアミド, SDS, ヘパリン, 比較表に ついては文献19を参照 [α-32P]dATP または [α-35S]dATP (24) dNTP, DINTP, 7-deaza-dGTP, ビオチン またはdigoxigenin-11-dUTP およびfluorescein-12-dUTP (19) ピロリン酸化ナトリウム, spermidine-HCl, グリセロール, ホルムアミド SDS, ヘパリン, 比較表に ついては文献19を参照 [α-32P]dATP または [α-35S]dATP (24) dNTP, DINTP, 7-deaza-dGTP, ビオチン またはdigoxigenin-11-dUTP およびfluorescein-12-dUTP (19) *The PCR process is covered by patents issued and applicable in certain countries. Promega does not encourage or support the unauthorized or unlicensed use of the PCR process. Use of this product is recommended for persons that either have a license to perform PCR or are not required to obtain a license. 28 RNAガイド本文 01.1.22 3:46 PM ページ29 Chapter 6 cDNA合成 ヒント cDNA合成の成否には、多くのパラメーターが関与していま す。下記にcDNA合成反応のためのヒントとガイドラインを紹 介します。 第1鎖および第2鎖の収量 − 第1鎖および第2鎖の合成では、約 350∼6000ヌクレオチド（第2鎖ではベースペア）のcDNAフラ グメントを生成します。cDNA合成を確認するためにアガロー スゲルで分析する必要があります。 EcoR Iアダプター − RiboClone® Systemに含まれるEcoR Iアダ プターは、cDNAフラグメントとの効率的なライゲーションの ために平滑末端側がリン酸化されています。 RNAがきちんと取れているかの確認 − 可能であれば、使用前 にRNAの完全性をゲルで確認します。mRNAを分解するRNase 活性を阻害するためにRNasin® Ribonuclease Inhibitorを加えま す。RNasin® Ribonuclease Inhibitorは、cDNAクローニングで 問題となるRNase H活性を阻害しません。 陽性コントロールの使用 −キットの内容物に問題がないことを 確認するために、各cDNAクローニング実験において陽性コン トロールを使います。 mRNAの純度 − 高純度に精製されたmRNAからスタートする ようにしてください。SDS、EDTA、多糖類および塩類は、す べて第1鎖cDNAの合成を阻害します。これらの試薬の混入が疑 われる場合は、mRNAサンプルの一部を陽性コントロール反応 に加え、第1鎖合成が阻害されるかどうかをアガロースゲル電 気泳動で調べます。 Sephacryl® S-400スピンカラムの使用 − Sephacryl® S-400を 充填したスピンカラムから溶液が適切に排出されない場合、カ ラムの上部に軽く圧力をかけて排出をスムーズにします。 Sephacryl® S-400をカラムに詰めるときに、カラムの先端に小 さな気泡がトラップされやすいので、溶液をカラムに流す前に 気泡を追い出す必要があります。 スピンカラムでの収量を確保する − Sephacryl® S-400スピンカ ラムからのcDNAの収量を確保するために、バッファーによる 平衡化を2回ではなく3回行ないます。 ヘアピン形成の抑制 − ピロリン酸ナトリウムを第1鎖cDNAの 合成反応に加えると、ヘアピン形成を抑制する効果があります。 DMSOでも同じ効果が見られます。15％のDMSOが第1鎖の合 成で合成効率を下げることなく使用されています(25)。 cDNAクローニング用のRNA − 単離されたmRNAでなく、total RNAを使ってのcDNAクローニングを行なうことは推奨できま せん。第1鎖合成において、32P-dCTPの取り込み効率の低下が 実験で確認されているためです。25~50µgのマウス肝臓からの total RNAとoligo(dT)プライマーを使って得られたデータでは、 ゲルによる分析で第1鎖cDNAが確認されませんでした。 cDNAの長さ − あるcDNA鎖では15kbpのものが合成されてい ます。第2鎖の合成は11℃で1時間、続いて22℃で1時間反応が 行なわれました。他の条件は通常の第2鎖の合成反応条件と同 じです(26)。 参考文献 Cohen, J.J. (1993) Immunol. Today 14, 126. Cleveland, D.L. and Ihle, J.H. (1995) Cell 81, 479. Tartaglia, L.A. and Goeddel, D.V. (1992) Immunol. Today 13,151. Kozak, M. (1983) Microbiol. Rev. 47. Eun, H.-M. (1996) Enzymology Primer for Recombinant DNA Technology, Academic Press, San Diego, CA, 427, 6. Gerard, G.F. and D'Alessio, J. (1993) In: Methods in Molecular Biology, Vol.16: Enzymes of Molecular Biology, Burrell, M.M.,ed., Humana Press, Totowa, NJ, 73. 7. Enzyme Resource Guide, Vol. I : Polymerases BR075A, Promega Corporation. 8. Colomb, M.et al.(1981) J Virol. 38, 548. 9. Roth, M. et al.(1981)J.Virol. Chem. 260, 9326. 10. Mallet, F. et al. (1998) BioTechniques 18, 678. 11. Gerard, G.et al. (1997) Mol. Biotech.8,61. 12. Retzel,E. et al. (1980)Biochem.19,513. 13. Enzyme Resources Guide, Polymerase, BR075A, Promega Corporation 14. Aimasri, N.M. et al.(1991) Am. J. Clin. Path. 95, 376. 15. DeSteano,J.J. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266,7423. 16. Busier, R.G. et al. (1991) J. Biol. 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Tech. 5, 57. 1. 2. 3. 4. 5. 製品案内 cDNA合成＆クローニングシステム 製品名 サイズ 1システム Universal RiboClone® cDNA Synthesis System 逆転写酵素 製品名 サイズ M-MLV Reverse 10000u Transcriptase, RNase H Muinus ( Point Mutant ) M-MLV Reverse 10000u Transcriptase, RNase H Muinus ( Deletion Mutant ) M-MLV Reverse 10000u Transcriptase AMV Reverse Transcriptase 300u カタログ番号 C4360 価格（￥） 79,000 カタログ番号 M3682 価格（￥） 26,000 M5301 20,000 M1701 9,000 M5101 14,000 29
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