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化場頁 4 ︱
ふ叩
寸第
道報さ告
海空
北研
サケ・アス魚類の卵および精子の保存に関する研究― 2
サケ
広井
((Oncorhynchus
十峯ア
Studies On
ん
安川
eta)精子の保存にっいて
雅対末
武
敏夫**
the Retention of Gametes
in Salmonid Fishes-2.
0n the Storage of Chum
Osamu
HIROI* Masao
Salmon (Oncorhynchus keta) Sperm
YASUKAWA* and TOshio SUETAKE*
Chum
salmon (Oncorhynchus
keta) sperm
was
obtained
from 23 male fish run up the Chitose
of NOvember,
1972 and stored in the dark ro0m showing the temperatures
of 15.0
t;, 8.0'G, 3.5@1.5f
and -9.0@9.0'G.
Milt of one-cc
was
taken in 12-cc open glass vials.
preserved was examined in the Ringer's solution &t every day under a
MOrtility of the spermatozoa
light microscope.
MOreover,
a lot of milt stored @n each
condition for 4 or ? days,
to assess
fertility, was employed to inseminate the eggs preserved for 1 or 4 days
in the Ringer's solution
Of 8. 0t.
The results obtained were &s follows:
1. Spermatozoa
stored &t the temperature
of 15. (TC,
8. 0t and S.S@1.5t! maintained
the
active mortility for 2, 6 and II days, respectively.
N0 mortility, however, was
shown
by the
milt stored at -9.0@9.0'C
even
one day after preservation.
2. Microbes of rod-, globe- or long spindle-shape were observed the milt preserved at 3. 5 @
1.5'C, 8. 0f and 15.01;.
They became visible in earlier time and increased more rapidly as the
milt was exposured at higher temperature.
3. The lot of milt stored for 4 days at 8.0'C could fertilize 89.3%
of the eggs
which were
preserved for 1 day &t 8.0'C in the Ringer's solution.
When the eggs storaged for 1 or 4 days
in the Ringer's solution of 8.0'C was inseminated with the sperm
kept for 4 or ? days at 3.5@1.5
f, fertilization rates of 96.9%
and 53.8%,
respectively, were obtained.
on
24th
・
River,
ま
え
が
き
さけ・ますの
人エふ化事業において
，悪環境条件での採卵に起因する不受精卵の
発生および過密度
菩技による
親魚の衰弱・乾死は近年・持に回帰親魚が
増加するにつれて・
頻繁にみられる
様になり，これらの
防止対策が強
北海道さけ・ますふ
化均研究業
筋第 234 号
，北海道さけ・ますふ
化均千
黄支均(Chitose Br吋
arLnfhOf HOkkkai七 Sal@on Hatchery,Chitose,Japan)
39
北海道さけ・ますふ
化場 : 研究報告第 27 号
多くは精子および
卵を正常な受精方を
維持したまま長期間保存する
方法が確
く要望されている。
これらの問題の
立できるならば
解?肖するであろう。
サケ・マス魚類の
精液の保存に関する研究はこれまで
，サケ，
Oncor ん叩。 Lus Aef0
195L 岡田・伊藤・
(山本， 1949 ，
1955; 岡田外・ 1956; 寺尾，1960) ，べ二マス・
O 偲r血 (FOerSter 1965;WiMer
・
・
BarreLt，
&Humph-
reys.1967)，サクラマ
矢， O mmn,sfo"( 中野・野沢，
1925) ．マスノスケ， O tschawytscha ，スチール・へ・ y ド，
SMmo
g0 汁』 n 打ぉ Rぬ rdnerii (Smi 十 5 QuiStorff， 1943) ，ニジマス．
S g0 汁伽erfi irideuS (橋本・ 1961)
および大西洋サケ・
S ． $0Mr
(TruSCott et al。 1967;HOyle も Idler ， 1968) を用いて行なわれている。
そして
・
・
・
これらの実験から
，いくつかの
有効な保存方法が
示されたけれども
，実用に供する
為には尚検討の必要がある。
著者らはサケ (O ， eM) の精液を容易に
準備できる条件で
保存実験を行なったのでその
結果を次に報告する。
止
稿を進めるに
先だち，木研究について
懇篤なる御指導と御助言を
賜わった北海道大学水産学部．山本喜―郎教
授に厚く御礼申しあ
げます。また，木研究に
用いたサケ卵および精子の
採取に多大の便宜を賜わった北海道きけ
ます増殖事業協会・
三原健夫会長，同西
越捕獲場，布施
智
常民および同捕獲場の
皆様に深甚の謝意を表します。
材料および方法
木研究に用いた
サケ (Oncorhynchus
ke@a) の精液は1972 年HH24
日に石@f 川水系千歳川の
北海道さけ・ます
搾出
増殖事業協会
西越捕獲場で得られた3 年魚21 尾および4 年魚 2 尾から搾出した。尿又は血液等の混入精液は
時に注意深く
観察しながら
取除き・可能な
限り純粋な精液のみを
採取した。搾出時の室温はI0.Fiでであった。搾
出した精液は
車で約20 分を要する北海道きけ・ますふ
化場千歳支場ふ化窒まで
水冷運搬した。運搬後すぐに，精
液は洗椴滅菌した広口ガラス
瓶 u2cc)
130 本に駒込ピぺ，トで各々 Icc 毎に小分けした。
精液を入れた瓶は水
．ゴム栓を通気を
妨げない程度に
軽く置いて．すぐに実験条件下に
静置した。この
分，ゴミ等の
混入を防ぐ為に
間のふ化室の
室温は6． oでであった。
精子は次の4 つの実験E に分けて保存した。
実験―1 : 暗室 (消灯) 内にヒーターを
用いて水温を15 0@C に調
・
卸した止水槽を
置き，その中に
精液を入れた瓶を浅漬した。
実験―2 : 暗室 (消灯) 内で8 での流水 (湧水)
に
精液を入れた
瓶を浸潰した。実験―3 :冷蔵庫 (日立) の冷蔵室 (室温3 ． 5 土 1.5q3) に精液を入れた
瓶を静置し
た。実験―4 : 冷蔵庫 (日立) の冷凍室 (室温―9 ．0 土 9.0て@) に精液を人れた
瓶を静置した。
，
各実験区とも毎日精子の
活方を調べた。
精子の活カは各実験区毎に
小瓶から精液をスライド・グラスにとり
それにサケ用生理食塩水
(山本， 1948)
を加えて精子の
運動能ヵを光字顕微鏡下で観察する
方法で判定した。
さらに・保存4 日問およびI 週間の精子は
夫々．
I 日および4 日間8 でで生理食塩水に
保存した同腹
来受精卵
を用いて，受精率を
調べた。同腹来受精卵は1972 年11M27
加．体重4 ， 800g)
日
同捕獲場で得た3 年魚 (フオーク・レングス．
74 2
・
から採取した。
来受精卵の保存方法は
前報 (高野外．
1973)
結
と同様である。
果
採取当日の精子は
生理食塩水で
稀釈することにより
活発な運動を
示した。精子は生理食塩水滴
下後25 秒間は活
発に運動するが・その
後運動は急速に
減衰し， 3m秒以降では僅かに動くのみであ
った。この精液で採
卵後2 時間
97 ． 0%
生理食塩水に
保存した来受精卵を
媒精したところ
実技― @
(来受精卵の66@
粒@中の6.T粒が受精) の受精率を得た。
暗室内でl5 での温度の下で
保存した楕液
実験期間を通じて・
保存瓶を浸潰した止水槽の
水温および室温は
夫々
・
15.0 士 0.5 でおよび7 ．0 士 3.0 での日間
変化を示した。
精子は保存
後 2 日間は採
精当日と変わりなく
生理食塩水で
稀釈することにより
活発な運動を
示した。ところが
保存3 日目では―部の
精子が極めて弱い運動を示すのみであ
り
・
しかも精液中には
桿形・球形および
長紡錘形の
細菌が観察された。
4 日目になると
，これらの細菌はさらに
増え・精子は
殆んど運動しなかった。
この精液で I
日間生理食塩水に
保存した未受精卵を媒精したところ，受精卵は
得られなかった(表― 1U 保存後 5 日目には精
液は採取時の
乳白色から黄白色に変わり
，透明な液状部分が
分離してみられた。
精液は大部分細菌で
占められ
・
40
サケ・マス魚類の
卵および精子の
保存に関する
研究―2
Table.
1.
MOrtility and fertility 0f the preserved
sperms
in various conditions
The
mark, ++,
+ and -, represents the grade of sperm
mortility; ++, most of spermatozoa
actively,
+, a part oF spermatozoa
show activity and -, none 0t spermatozoa
show activity
in the Ringer's
solution.
Fertility o[ spermatozoa
was determined by the test which
inseminated
the eggs preserved in the Ringer's solution.
move
表― @
保存桔子の活ヵと受精ヵ
++; 全ての楕子が駒方を侍っ
+ ; ―部分の格子が辺劫ヵを持っ
- ; 箱子は闘力を示さない
完全な形の精子は
殆んどみられず，
僅かに変形した
球形小型の精子の
頭部がみられるのみであ
った。
実技―2
暗室内で8 での温度の下に
保存した箱液
る。
保存瓶を浸潰した流水水温は
実験期間を通して8 ． on であった。室温は実験―1 の場合と同様であ
精子は保存後 6 日間まで活発な
運動方を示した。
精液は保存期間が
長くなるにつれて
粘性が高くなった。
4
日
間保存の精液を
用いて8L の生理食塩水にI 日間保存した
未受精卵を媒精したところ，
89 3% の受精率を得た(表
・
精子は生理食塩水を
滴下しても同ら反応を示さず
，精液中には
細菌が繁殖していた。
― 10 しかし 7 日間保存した
この精液で 4 日間保存した
未受精卵を媒精した結果，受精卵は
得られなかった(表― 1U 保存8 日以降の精液は
黄自色に変わり・
完全な形の精子は
認められなかった。
実験―3
冷蔵庫で3． 5土 l.5f の下に保存した
精液
冷蔵庫の冷蔵室の室温ば実験期間を
通して，3 ． 5 士 1.5 でを示していた。
精子は保存後1l 日間活発な運動を
示したが・精液は
保存期間が長くなるにつれて
粘性を増した。4 日間および
7 日間保存した
精液で8@C の生理食塩水に
大々 1 日および4 日間保存した
未受精卵を媒精したところ．
夫々9f 9
・
% および53.8% の受精率を得た(表 ― 1)n この受精華は
同様に保存した
来受精卵を新鮮な
精液で媒精した場合と
あ
まり変わりない
成績であった (1 日間保存，
97.2%0; 4 日間保存．
47.8%:
高野外，19730 ―方．保存後12
日
から 18 日になると―部の
精子のみが生理食塩水に
対し反応を示す
様になり．さらに保存日数が
増すに従い．運動
する精子の数は減少した。さらにこの期間に
精液中に細菌の
繁殖がみられ．保存期間が
長くなるにつれて
増加し
・
た。保存後19 日以降では精子の
活動は認められなくなり．それに
代って細菌は
急速に増加した。
保存??日目以降
では精液の
殆んどが
湘@菌で占められ
，正常な形の
精子がみられなくなると
同時に精子は
乳白色から黄白色に変わ
だ
実験―4
冷蔵庫で― 9 士 9 でに凍結保存した
精液
冷蔵庫の冷凍室の
室温は実験期間を
通して ― 9 ．0土 9.0@C であった。
・
精子は18 日間保存したが
，いずれの日にも
活動カがみられなかった。
もちろん4 日および7 日の受精の際も
受
室温で溶解させた後では
精液は凝縮した
精子の部分と液状の剖
精卵は得られなかった(表 ― 1o 凍結した精液を
分に分離した。
精液中には細菌の
発現はなかった。
41
北海道さけ・ますふ
化場 : 研究報告第 77 号
察
考
岡田・伊藤u955)
カ
はサケ
(Oncorhynchus
ke@a) 精液をいくつかの
温度条件で保存し
，淡水中の精子の
運動
と新鮮な
来受精卵に媒精した場合の受精
カ (受精率)
を上
ヒ
較した。その結果・
or,
55でおよびnr で保存し
た精液は活カ喪失の殆んど直前まで
受精方を保有することを
確めた。この事実がそのまま
我々の実験にあてはめ
得るならば・
6 日間・
生理食塩水賦活により
，精子の殆んどが活発に
運動した期間，
即わち・
15 ． 0@C で2 日間． 8 ． of で
3 ． 5士 1.5 でで11 日間精子は受精方を
保有したと考えられる。
我々の結果は低温
程精子の受精カが長期間
保持されることを
示している。
同様の事実は
比較的短期間の
試験ではあるが，同じくサケで
山本け 949) ¥@ よっ
て述べられている。
山本 u949)
は 3-6@C
に保存した精液中の
精子は8 時間まで活動カも受精カも搾出直後と
殆んど変わらず
， 16 時間後でも大部分のものが
活発に運動するが・
13-16 での温度では3 時間後で既¥- 不活性な
精子が認められ
， 5 時間後ではすべての
精子が活動ヵを示さなくなると
報告している。
保存温度と精子の
活ヵ保
有期間に関連して
，岡田・伊藤u955)
は 5 でから3syc までの8 段階の温度でサケ
精液を保存した
結果から，保
活ヵ保有期間 (y ) の問にx
存温度 (x ) と精子の
の場合の保存温度は
岡田・伊藤u955)
Barrett
(1951)
は 2 ． 5-5
(y +1.1)
-45 の曲線的相関があ
ることをみっけた。
我々
のそれと異なるが
，得られた結果は
彼等の相関式を
支持した。
． 8@C の温度でサケ精液を
保存した場合，受精
カ (90% 以上の受精率) は 36時間後ま
でしか保持きれないと
報告している。
我々の結果では類似の
温度 (3.5+1 ． 5@C) で保存し24 日後でも96.9%0の受
精率を得ており
， Barrett
の結果よりはるかに
良い成績を得た。
この相違は保存容器の
通気効果の差によって
生
じたものと推定される。
べ二マス (0.nerka)
― 9 でではU 時間 (Withler
&
に 2 ．士 C入れて密栓して．
8-9
がみられている(WiWer
HumphreyS
でで保存したカラフトマス
(O ． goHu5cA
も HumphreyS
するとスチール・
へッド (SMmo
の精子は5 て@で密栓して保存すると
26 時間 (FOerster,1965)
め
精子では33時間後で受精率の降下
． 1967) 。同様に保存容器―杯に
精液を入れて密栓し， 6H-7
goirdne
，
H
goi ， d庇
． 0でで保存
H りでは2 ． 5時間後で，マスノスケ (O ． L 。 hWyt5cA
は 5 時間後で受精カが減衰する(Smith
R QuLto
CC の容器に入れて
密閉し．6 ． 0-13.0@C
で保存すると4
いる
， 8
， 1967) 以降で顕著な
受精カの減衰がみられている。
精液を25cC の瓶
日
。) で
佃 s0 めの精・液を 70
(97 時間) 後でも受精カ (受精率95.2%) を保持して
。 rf， 1943L
ところが湖水産サクラマス
(0 ．
(中野・野沢．
1925)o この場合では
保存容器の容積が
大きい鳥，精子は
長時間空気の
供給を得たものと
推察
される。
Truscott
et
al u967)
・
は大西洋サケ(S ．，alar)
の精液を
20cc の瓶にIcc 入れ・通気して2 ． O@C で保
存すると5 日間新鮮な精子と
殆んど変わらない
受精率を示すが
，同じ条件で
密栓して保存すると
I 日後で既に受
精率は60% 以下に降下すると
報告している。
彼等は密封した場合は
精子の代謝によって
生じる二酸化炭素ガスの
毒性，ガスによる
精液のpH の降下，又は酸素不足によって
精子が害されると
考えている。この様な空気の
遮断
の影半は通気して保存したサケ
精液の場合でも
精液の空気と
接触しない内層部に認められ・
内層部の精子の活カ
19550 同じく，
保有期間は空気に
接している表層部に
比して著しく
差があることが知られている(岡田・伊藤，
岡田・伊藤u955)
はサケ精液をicc アンプルに
―杯に詰めて密封し・
空気を遮断して
保存したところ・
精子は
0@C では約3 時間，n でおよび20f では約I 時間で活方を喪失するが，その
後空気に接触させておくと
，次第に
活方を回復し
．しかも低温
程より短時間で
活方を取戻すことを
観察した。この結果について・
彼等は空気遮断に
よって炭酸ガスの
蓄積が高まり
精子を麻樺させていたものが
，通気によって
炭酸ガスの拡散と
酸素の供給がなさ
麻庫状態から解放されることを
意味すると述べている。
又，酸素消費量で
観察した精子の
基礎代謝
れて．精子は
は温度が高い
程大きくなることがサケ
精液で報きされている(岡田外．1956L 即わち，精液Icc は 10 ． 8@C で I 時
間に21mm3 の酸素量を消費するが．
18.7 でではその量は約4 ． 5倍の94mm ，にも達する。
これらの事実および
我々の結果は精子の
保存に際して・1) 精液が空気に接する表面積を
充分大きくとれる
容
重要であることを示している。
器を用いること．2) 充分な通気を行なうこと．および 3) より低温に置くことが
我々は実験期間を
通して細心の
旺意をはらったにもかかわらず
，常温で保存した
精液のいずれにも
細菌の繁殖
がみられた。
細菌の出現および
繁殖の速度は高温程早かった。いずれの場合も
，保存精子の
活カが喪失する以前
に細菌が出現し
，細菌が増加する
時点で精子の
活カの低下がみられ・
精子の死後急激に
繁殖する。このことは細
思われる。
サケ精液保存中の
細菌の出現については
菌が精子の活カ保有に対して
大きな影牛を与えているように
42
サケ・マス魚類の
卵および精子の
保存に関する研究―2
寺尾 u960)
が 2-4
での保存実験で
報告し，末薔の精液保存等で
用いられている
抗生物質の必要性を
強調して
いる。細菌は精液自体から・
又空気から由来すると
考えられ．これを排除することは
極めて困難である。何故な
先に述べたように
常温下での精液の
保存には通気が
絶対条件となるからであ
る。このことから．精液を
長
らぱ・
期間保存する為には細菌の
繁殖を阻止しうる
凍結保存法を考える必要があ
ろう。
我々はサケ精液を二9.0土 9.0でで凍結保存したところ
，実験期間 (22日間) を通して，細菌の
出現はみられな
かったが・精子の
活カも又，完全に喪失することを
確認した。これは明らかにサケ
精子の保存の
場合にも適当な
保存稀釈液が必要であ
ることを示している。
色類精子のO で以下の保存に
関して，いくつかの
報告がみられる。
B@axter (1953) は二シン (Clupea harengus} の精液を% 海水の12 5% グリセリン溶液で稀釈し，ドライ・ア
イス (solidcarbon dioxide) を用いて． ― 79.0@C.@-@
凍結保存したところ
，約6 ケ月保存後で80% および85% の受
精率を得ている。
TruSCottet al． u96n は大西洋サケ (S ． SOlM) の精液を5% DMS (dlme 小 yl Su@phoxide)
で稀秋し ― 4． 5C で保存28 日後に81%0 の受精率を，又5% EG (ethylene g@ycoD で稀釈し， ― 3 0でで38 日後
に 70% の受精卵を確認した。
サケ精液では
寺尾 u960) が―40--50 でで生理食塩水に
稀釈した場合2 日間． 5
% 又は10% グリセリン
液で3 日間， 15% グリセリン
液で4 日間．卵ク液 (3% クェン酸ソーダに等量の
鶏卵黄を
・
・
混合) で I 日間精子は活方を
保有することを報告している。
これらの結果を
参考として．サケ・マス
魚類精液の
関する基礎研究を
進める必要があ
ろう。
より有効なより簡便な凍結保存法に
・
きて，我々は常温の
3 ． 5士 1.5f で7 日間，
市販の冷蔵庫の冷蔵室保存であり，
8． Of
8 O でで4 日間サケ精液を
確実に保存しえた。
しかも 3.5 士 1 5では
・
・
はふ化用水に
浸しただけの極めて簡単な方法であることはきけ・ます
人エふ化事業の中に
手軽に応用しうる
利点をもっている。
実際にこの研究の
中で示したように
冷蔵庫 (3.5 bl 5
二
@C)
に 4 日間保存したサケ
精液を同じく生理食塩水に
入れて8
常な採卵に劣らない
96.9%
・
・
O@C で I 日保存した来受精卵に
媒精したところ正
の受精率を得た。これらの結果が
今後ふ化事業の中で，作業能率の
向上．過密度蓄養
の解消又は悪条件下での
採卵から生じる不受精卵の解消等に
応用きれうるならば
，この上ない
幸いである。
要
糸勺
ぁ3守 Jll水系千歳f1@で捕獲したサケの
雄完熟魚23 尾から搾出した精液の
保存実験を行なった。
場合，精子は2 日間， 8 ． Of で暗室 (消灯) 内に保存の精子は
6
I ．精液を15.0 でで暗室 (消灯) 内に保存した
日間・冷蔵
庫の冷蔵室 (3.5
士
1.5 で ) に保存の精子は
n 日間，夫々新鮮な精子と
同じ活方を保持した。しかし
ながら，冷蔵
庫の冷蔵室 (― 9 ． 0+9.0@C}
t@@凍結保存した精子はI 日後で既に活方を
喪失していた。
2 ．常温保存の
精液にばいずれにも
，桿状・球状又は長紡錐状の細菌の
繁殖がみられ，しかも細菌の
出現および
繁殖速度は高温
程速かった。細菌は精子の活カ喪失以前に出現し．精子の
活カ喪失時まで除々に増加し．精子
の死後・急激に
繁殖した。
精子を8 ． or@ で I 日間生理食塩水に
保存した来受精卵に
媒精したところ．
89.3% の受
3 ． 8 ． OV で 4 日間保存した
精卵を得た。3 ． 5+1.5c@:4
日間および7 日間保存した
精子を8 OV で生理食塩水に
去々 I 日間および4 日間
・
保存した未受精卵に
媒精したところ・
96.9% および53.S% の受精率を得た。
文
Barrett, 1. 1951.
Fertility
of salmonid
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and
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貯蔵精子の賦活について―予報．水産増殖
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広井イ惨
血$
in wa 低 r and
・
・安川雅夫末武敏夫・佐々木正三・富田竹
雄，左藤幸男 1973 ．
・
ん
イ
eM) 卵の発生にっいて(予報)．さけ・ます人所報 27 ， 25-30
43
・
・
Oncorhynchiis
22 ， 1503-1521
8 での湧水に於ける
サケ(OncoHwc-
北海道さけ・モすふ化場 :研究報告第 27
HOy@e
．
R ． J． & D ． R ．
AtlantlC Salmon
中野宗治・野沢
鑑
Idler 1968
(SMmo
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