QUANTA Lite® HA dsDNA ELISA

QUANTA Lite® HA dsDNA ELISA
Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση
704615
CLIA σύνθετος: ψηλός
Ενδεικνυόμενη Χρήση
Αυτή η ανάλυση προορίζεται για την εργαστηριακή μέτρηση των ειδικών υψηλής συνάφειας αυτοαντισωμάτων IgG
έναντι διπλής έλικας δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος (dsDNA) τα οποία υπάρχουν στον ορό, ως βοήθεια, για την
διάγνωση του συστηματικού ερυθηματώδους λύκου (SLE), σε συνδυασμό με άλλα αποτελέσματα ορολογικών
δοκιμασιών και άλλα κλινικά ευρήματα. Παρέχονται επαρκή υλικά, για την εξέταση έως και 40 δειγμάτων εις
διπλούν, ή 88 μονών δειγμάτων, με καμπύλη βαθμονόμησης καθώς και θετικός, αρνητικός και μονής ελικας DNA
ορός ελέγχου.
Περίληψη και επεξήγηση της δοκιμασίας
Η χρήση των αντισωμάτων ένατι dsDNA ως διαγνωστικού δείκτη για ΣΕΛ και στην παρακολούθηση της
ενεργότητας της νόσου, αποτέλεσε εξέταση μεγάλης χρησιμότητας για τους κλινικούς από τότε που
1
2
αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά από τους Ceppelini et al το 1957 και επιβεβαιώθηκε από την εισαγωγή της το
3
1982 στα αναθεωρημένα από το American College of Rheumatology κριτήρια για την κατάταξη του ΣΕΛ .
Σήμερα, χρησιμοποιούνται συχνά τρεις μέθοδοι ανάλυσης που διαφοροποιούνται με βάση την συνάφεια των
4
αντισωμάτων έναντι dsDNA που ανιχνεύονται . Οι ανοσοενζυμικές μέθοδοι (ELISA) οι οποίες περιλαμβάνουν
πολλές παραλαγές ανιχνεύουν ένα ευρύ φάσμα συνάφειας των αντισωμάτων. Η μέθοδος ανοσοφθορισμού (IFA)
Crithidia lucilae χρησιμοποιείται για την ανίχνευση αντισωμάτων με βάση τη χαμηλότερη συνάφειά τους ενώ η
5
μέθοδος Farr ραδιοανοσοανάλυσης (RIA) μετρά μόνο υψηλής συνάφειας αντισώματα λόγω της χρήσης θειικού
αμμωνίου που αποκλείει τα αντισώματα χαμηλής συνάφειας.
8
Η μέθοδος HA dsDNA ενσωματώνει ένα πιο αυστηρό σύνολο προϋποθέσεων που έχουν ως σκοπό την
απομάκρυνση των χαμηλής συνάφειας αντισωμάτων που έχουν προσδεθεί ασθενώς.
6,7
Κάποιες μελέτες απέδειξαν μια συσχέτιση μεταξύ της συνάφειας των αντισωμάτων και της εξέλιξης της νόσου
όπου η επιλογή της μεθόδου διευκολύνει τη διάκριση ανάμεσα σε ασθενείς με καλοήθη μορφή ΣΕΛ και σε εκείνους
8,9
με δερματική και νεφρική επιπλοκή κυρίως σε περιπτώσεις νεφρικού λύκου .
Γενικά υπάρχει καλή συμφωνία μεταξύ όλων των αναλύσεων χρησιμόποιώντας ορό από ασθενείς με «ξεκάθαρο»
συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (ΣΕΛ), ωστόσο σε ασθενείς με μη ενεργή νόσο , ή η σε αυτούς που δεν υπόκεινται
στην καθορισμένη κατάταξη για ΣΕΛ, υπάρχει σημαντική ασυμφωνία.
Αρχές της Διαδικασίας
Τα μικροβυθίσματα προ-επικαλύπτονται με αντιγόνα dsDNA από θύμο βοός. Κατόπιν, προστίθενται στα βυθίσματα
οι οροί ελέγχου, και τα αραιωμένα δείγματα ασθενών και τα αυτοαντισώματα που αναγνωρίζουν το αντιγόνο
dsDNA, δεσμεύονται κατά την πρώτη επώαση. Μετά την πλύση των βυθισμάτων για να αφαιρεθούν όλες οι μη
δεσμευμένες πρωτεΐνες, προστίθεται σύζευγμα κεκαθαρμένης, αντιανθρώπινης IgG κονίκλου σημασμένης με
υπεροξειδάση Το σύζευγμα δεσμεύεται στο αιχμαλωτισμένο ανθρώπινο αυτοαντίσωμα, και το πλεονάζον μηδεσμευμένο σύζευγμα, αφαιρείται με ένα ακόμη στάδιο πλύσης. Το δεσμευμένο σύζευγμα γίνεται ορατό με
υπόστρωμα 3,3’,5,5’ τερα-μεθυλ-βενζιδίνης (TMB) το οποίο δίνει ένα προϊόν μπλέ αντίδρασης, η ένταση της οπόιας
είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αυτοαντισώματος στο δείγμα. Προστίθεται θειικό οξύ, οξύ σε κάθε βύθισμα
για να σταματήσει η αντίδραση. Αυτό παράγει στο τέλος ένα χρώμα κίτρινο το οποίο , κατόπιν, διαβάζεται στα
450nm.
Αντιδραστήρια
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με ανασυνδυασμένο dsDNA από θύμο βοός
(12-1 x 8 κοιλότητες) με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά
ELISA Αρνητικός Έλεγχος, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και ανθρώπινο
ορό χωρίς ανθρώπινα αντισώματα έναντι του dsDNA, προαραιωμένο 1,2ml
HA dsDNA ELISA Βαθμονομητής A, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και
αντισώματα ανθρώπινου ορού έναντι του dsDNA, προαραιωμένο, 1,2ml
HA dsDNA ELISA Βαθμονομητής B, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και
αντισώματα ανθρώπινου ορού έναντι του dsDNA, προαραιωμένο, 1,2ml
HA dsDNA ELISA Βαθμονομητής C, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και
αντισώματα ανθρώπινου ορού έναντι του dsDNA, προαραιωμένο, 1,2ml
HA dsDNA ELISA Βαθμονομητής D, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και
αντισώματα ανθρώπινου ορού έναντι του dsDNA, προαραιωμένο, 1,2ml
HA dsDNA ELISA Βαθμονομητής Ε, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και
αντισώματα ανθρώπινου ορού έναντι του dsDNA, προαραιωμένο, 1,2ml
HA dsDNA Θετικός Έλεγχος, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα
ανθρώπινου ορού έναντι του dsDNA, προαραιωμένο, 1,2ml
Type III Δείγμα Αραιωτικό δείγματος, 2 φιαλίδια – χρώμα κίτρινο, που περιέχει Tween 20, σταθεροποιητές
πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50mL
HA dsDNA Συμπύκνωμα πλύσης (10x), 2 φιαλίδια των 10x συμπυκνωμάτων – άχρωμος, που περιέχει Tι
Tween 20 και συντηρητικό, 50mL. Ανατρέξτε στην ενότητα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης.
HA dsDNA Ενιαίος προσαραγμένος έλεγχος, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό
και αντισώματα ανθρώπινου ορού έναντι του ssDNA, προαραιωμένο, 1,2ml
HA dsDNA IgG Σύζευγμα, αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο – μπλε χρώματος, που περιέχει ρυθμιστικό
διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10mL
TMB Χρωμογόνο, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10mL
HRP Διάλυμα διακοπής, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο – άχρωμο, 10mL
1
Προειδοποιήσεις
1.
Προειδοποίηση: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0,02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος,
στους ορούς ελέγχου, Αραιωτικό και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας
ότι προκαλεί καρκίνο. Το πλύσιμο και Δείγμα Αραιωτικό δείγματος περιέχετε Proclin 150. Αποφύγετε
2.
Όλα τα ανθρώπινα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν στην προετοιμασία των πρότυπων ορών για αυτό το
προϊόν έχουν εξεταστεί και βρέθηκαν αρνητικά για αντισώματα HIV, HBsAg και HCV από εγκεκριμένες
μεθόδους FDA. Ωστόσο, καμία μέθοδος ελέγχου δεν μπορεί να προσφέρει πλήρη διασφάλιση για την
απουσία των HIV, HBV, HCV ή άλλων μολυσματικών παραγόντων. Κατά συνέπεια, το HA dsDNA Θετικός
Έλεγχος, το HA dsDNA ELISA Βαθμονομητής A μέσω E, HA dsDNA Ενιαίος προσαραγμένος έλεγχος και ο
ELISA Αρνητικός Έλεγχος θα πρέπει να χειρίζονται με τον ίδιο τρόπο όπως τα δυνητικά μολυσματικά
12
υλικά.
Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και δύναται
να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης ή απορρόφησης μέσω του δέρματος ή των ματιών. Το αζίδιο
νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση
δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Ξεπλύνετε τις λεκάνες απόπλυσης εάν
χρησιμοποιούνται για την απόρριψη του αντιδραστηρίου, με άφθονο νερό ώστε να αποφευχθεί η
συγκέντρωση των αζιδίων.
Το σύζευγμα HRP περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν
γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Για την πρόληψη πιθανών εγκαυμάτων αποφύγετε την επαφή
με τα μάτια και το δέρμα.
Το TMB χρωμογόνο περιέχει μια ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν εισπνευσθεί,
καταποθεί ή απορροφηθεί από το δέρμα. Για την πρόληψη τραυματισμού, αποφύγετε την εισπνοή, την
κατάποση ή την επαφή με το δέρμα ή τα μάτια.
Το HRP διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) αποτελείται από ένα αραιωμένο διάλυμα θειικού
οξέως. Αποφύγετε την έκθεση σε βάσεις, μέταλλα, ή άλλα μείγματα που δύναται να αντιδράσουν με οξέα.
Το θειικό οξύ είναι δηλητήριο και διαβρωτικό και επομένως μπορεί να είναι τοξικό εάν καταποθεί. Για την
πρόληψη εγκαυμάτων αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα.
Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο ατομικό προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια
που παρέχονται.
Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς,
εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων.
κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Προφυλάξεις
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro
Το προϊόν πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο από κατάλληλα εκπαιδευμένο προσωπικό.
Συνιστάται αυστηρή προσκόλληση στο πρωτόκολλο. Οπιοιαδήποτε παρέκκλιση πιθανόν να επηρεάσει την
απόδοση της ανάλυσης και τα προερχόμενα, από αυτήν, αποτελέσματα. Δώστε προσοχή στις ιδιαίτερες
«Σημειώσεις» και προειδοποιήσεις σε όλο το τμήμα των Οδηγιών Χρήσης.
Αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες ΔΕΝ ανταλλάσσονται μεταξύ τους. Εαν διενεργούνται μεγάλοι
αριθμοί εξετάσεων, πρέπει να δοθεί προσοχή στο να προέρχονται όλα τα αντιδραστήρια από την ΙΔΙΑ
παρτίδα. Όλες οι ταινίες πρέπει να λαμβάνονται από την ίδια σακούλα αλουμινίου. Υποκατάσταση
οποιουδήποτε συστατικού μπορεί να επιφέρει λανθασμένα αποτελέσματα.
Για να αποφύγετε μόλυνση των αντιδραστηρίων, χρησιμοποιείτε μόνο καινούργια ή καθαρά πλαστικά
/γυάλινα σκεύη. Ποτέ μην επιστρέφετε αχρησιμοποίητα αντιδραστήρια στις φιάλες.
Μην αφήνετε φιαλίδια αντιδραστηρίων ακάλυπτα· οποιαδήποτε εξάτμιση ή επιμόλυνση θα οδηγήσει σε
λανθασμένα αποτελέσματα.
Το υπόστρωμα TMB δεν πρέπει να εκτεθεί σε φως ή νερό.
Οροί και δείγματα τα οποία είναι μικροβιακά μολυσμένα, αιμολυμένα ή λιπαιμικά και περιέχουν σωματιδιακή
ύλη, δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται.
Η ανακριβής αραίωση του δείγματος δεν μπορεί να ελεγχθεί, καθώς οι οροί ελέγχου του διαγνωστικού
συνόλου, είναι έτοιμοι προς χρήση. Συνιστάται η χρήση βαθμονομημένων πιπεττών και κατάλληλων
δειγμάτων που έχουν υποστεί εσωτερικό ποιοτικό έλεγχο.
Η χρήση αυτοματοποιημένων συστημάτων ανάλυσης, αραιωτών δείγματος και άλλου αυτοματοποιημένου
εξοπλισμού μπορεί να οδηγήσει σε διαφορές μεταξύ αποτελεσμάτων που προέρχονται από
αυτοματοποιημένες διαδικασίες και διαδικασίες χειρός. Εναπόκειται στην ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να
αξιολογήσει πλήρως το σύστημα, και να διασφαλίσει τα αποτελέσματα να βρίσκονται μέσα στα όρια, όπως
αυτά ορίζονται σε αυτό το ένθετο, και όπως σχετίζονται με το πιστοποιητικό του ποιοτικού ελέγχου.
Όλος ο χρησιμοποιούμενος εξοπλισμός πρέπει να βαθμονομείται και να διατηρείται σύμφωνα με τις οδηγίες
του παρασκευαστή.
Συνθήκες αποθήκευσης
1.
2.
3.
Το κιτ πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8°C και δεν πρέπει να καταψύχεται. Ακατάλληλες θερμοκρασίες
αποθήκευσης θα επηρεάσουν τα αποτελέσματα.
Το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για 1 βδομάδα στους 2-8°C.
Η ημερομηνία λήξης του κιτ εμφανίζεται στην εξωτερική ετικέτα.
Συλλογή δείγματος
1.
2.
3.
4.
Τα δείγματα αίματος πρέπει να συλλέγονται με φλεβοκέντηση να τους επιτρέπεται να πήζουν φυσικά και να
διαχωρίζεται ο ορός.
10
Ο ορός μπορεί να αποθηκεύεται στους 2-8°C για έως και 7 ημέρες πριν από την ανάλυση , ενώ για
παρατεταμένη αποθήκευση, πρέπει να διαιρείται και να αποθηκεύεται στους 20°C ή σε χαμηλότερη
θερμοκρασία.
Η επανειλημμένη τήξη και ψύξη πρέπει να αποφεύγεται.
Τα δείγματα ορού δεν πρέπει να αδρανοποιούνται με θέρμανση, καθώς αυτό μπορεί να οδηγήσει σε
ψευδώς θετικά αποτελέσματα.
2
Διαδικασία
Υλικά που παρέχονται
• Φυλλάδιο οδηγιών: Παρέχει πλήρεις λεπτομέρειες της ανάλυσης.
• Πιστοποιητικό QC: Υποδεικνύει την αναμενόμενη απόδοση της παρτίδας.
• Κοιλότητες Επικαλυμμένες με HA dsDNA: 12 διασπάσιμα 8 λωρίδες κοιλοτήτων επικαλυμμένες με Βυθίσματα
με επίστρωση dsDNA. Κάθε πλάκα είναι συσκευασμένη σε μια επανασφραγιζόμενη αλουμινένια συσκευασία
που περιέχει δύο αφυγραντικές σακούλες.
• Type III Αραιωτικό Δείγματος: 2 φιαλίδια που περιέχουν 50mL ρυθμιστικού διαλύματος για την αραίωση του
δείγματος. χρώμα κίτρινο, έτοιμο για χρήση.
• HA dsDNA Συμπύκνωμα Πλύσης (10x): 2 φιαλίδιο που περιέχει 50mL ενός 10-άκις συμπυκνωμένου
ρυθμιστικού διαλύματος για την πλύση των κοιλοτήτων.
• HA dsDNA Βαθμονομητές: 5 φιαλίδια, το καθένα περιέχει 1,2mL αραιωμένο ανθρώπινο ορό, με τις ακόλουθες
συγκεντρώσεις αυτοαντισωμάτων αντι-dsDNA: 1000, 333, 111, 37, 12,3 IU/mL. Έτοιμο για χρήση.
• HA dsDNA Θετικός Έλεγχος: 1 φιαλίδιο που περιέχει 1,2mL αραιωμένου ανθρώπινου ορού. Η αναμενόμενη
τιμή παρέχεται στο πιστοποιητικό QC. Έτοιμο για χρήση.
• ELISA Αρνητικός Έλεγχος: 1 φιαλίδιο που περιέχει 1,2mL αραιωμένου ανθρώπινου ορού. Η αναμενόμενη
τιμή παρέχεται στο πιστοποιητικό QC. Έτοιμο για χρήση.
• HA dsDNA Ενιαίος προσαραγμένος έλεγχος: 1 φιαλίδιο που περιέχει 1,2mL αραιωμένου ανθρώπινου ορού.
Η αναμενόμενη τιμή παρέχεται στο πιστοποιητικό QC. Έτοιμο για χρήση.
• Σύζευγμα HRP HA dsDNA IgG: 1 φιαλίδιο που περιέχει 10mL κεκαθαρμένης υπεροξειδάσης με
προσδιοριζόμενη με ετικέτα αντίσωμα σε ανθρώπινο IgA. Μπλε χρώμα. Έτοιμο για χρήση.
• Χρωμογόνο TMB : 1 φιαλίδιο που περιέχει 10mL υποστρώματος TMB. Έτοιμο για χρήση.
• HRP Διάλυμα Διακοπής: 1 φιαλίδιο που περιέχει 10mL Θειικού οξέος 0.344M . Έτοιμο για χρήση.
Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται
• Αυτόματη συσκευή πλύσης πλάκας μικροπλακών: Αυτή η συσκευή συνιστάται, ωστόσο, η πλύση των
πλακών μπορεί να γίνει δια χειρός.
• Συσκευή ανάγνωσης της πλάκας: Ικανή να μετρήσει οπτικές πυκνότητες στα 450nm αναφερόμενα στον αήρ.
• Αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό: Αυτό θα πρέπει να είναι της καλύτερης διαθέσιμης ποιότητας
• Βαθμονομημένες μικροπιπέτες: Για την προσθήκη 1000, 100 & 10µL
• Πιπέτα πολλαπλών καναλιών: Συνιστάται για την προσθήκη όγκου 100µL συζεύγματος, υποστρώματος και
διαλύματος διακοπής.
• Γυάλινα/πλαστικά σωληνάρια: Για την αραίωση του δείγματος
Μέθοδος
Πριν ξεκινήσετε
1.
2.
3.
4.
5.
Αφήστε το διαγνωστικό σύνολο να έλθει σε θερμοκρασία δωματίου
• Το διαγνωστικό σύνολο είναι σχεδιασμένο να λειτουργεί σε θερμοκρασία δωματίου (20-24°C).
• Αφαιρέστε Το Διαγνωστικό Σύνολο από τον χώρο αποθήκευσης και αφήστε το σε θερμοκρασία
δωματίου επί περίπου 60 λεπτά. Τα βυθίσματα να μην αφαιρούνται από την θήκη αλουμινίου έως ότου
φθάσουν σε θερμοκρασία δωματίου. Σημειωση: Τα Διαγνωστικά Σύνολα μπορεί να διατηρηθούν σε
θερμοκρασία δωματίου επί έως και μια εβδομάδα.
Συστατικά διαγνωστικού συνόλου
Ανακατέψτε ήπια κάθε συστατικό του διαγνωστικού συνόλου, προ χρήσης.
Αραίωση πλυστικού διαλύματος
Τοποθετείστε 100mL του συμπυκνωμένου πλυστικού διαλύματος σε 900mL απιονισμένο νερό (αραίωση
1/10) μέσα σε καθαρό δοχείο και ανακατέψτε. Μικρότεροι όγκοι πρέπει να αραιώνονται καταλλήλως.
Σημειωση: Σημείωση: Το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για 1 εβδομάδα στους
2-8°C, και ως εκ τούτου, αραιώστε την κατάλληλη ποσότητα.
Αραίωση δείγματος
Αραιώστε 10µL κάθε δείγματος με 1000µL του δείγματος του διαλύτη (1:101) και ανακατέψτε καλά.
Σημειωση: Το αραιωμένο δείγμα πρέπει να χρησιμοποιείται μέσα σε 8 ώρες.
Χειρισμός ταινιών και πλαισίων
Τοποθετείστε τον απαιτούμενο αριθμό βυθισμάτων στη βάση στήριξης των ταινιών. Ξεκινήστε την
τοποθέτηση από το βύθισμα A1, γεμίζοντας τις στήλες κατά μήκος της πλάκας από αριστερά προς τα
δεξιά. Κατά τον χειρισμό της πλάκας, πιέστε τα μακρύτερα άκρα του πλαισίου, προκειμένου να
προφυλάξετε τα βυθίσματα από το να φύγουν από την θέση τους. Σημειωση: Επανατοποθετείστε τα
αχρησιμοποίητα βυθίσματα αμέσως στη σακούλα αλουμινίου με τις δύο αποξηραντικές θήκες και
επανασφραγίστε σφιχτά, προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η έκθεση στην υγρασία. Προσέξατε να μην
τρυπήσετε ή σκίσετε την σακούλα αλουμινίου, δείτε παρακάτω.
ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Η έκθεση των βυθισμάτων σε συνθήκες υγρασίας ή μόλυνσης από σκόνη ή άλλη
σωματιδιακή ύλη, θα έχει ως αποτέλεσμα την αποικοδόμηση του αντιγόνου, επιφέροντας μειωμένη
ακρίβεια στην ανάλυση, και εν δυνάμει ψευδή αποτελέσματα.
Διαδικασία ανάλυσης
1.
Πρόσθεση δείγματος
Διανείμετε 100µL του κάθε αντιδραστηρίου βαθμονόμησης,(ποσοτική ανάλυση) ή του οριακού ορού
ελέγχου (ποιοτική ανάλυση), του κάθε ορού ελέγχου και του αραιωμένου (1:101) δείγματος στα κατάλληλα
βυθίσματα της παρεχόμενης πλάκας. Σημειωση: Τα δείγματα πρέπει να προστεθούν στην πλάκα, το
συντομότερο δυνατόν, προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η παρέκκλιση της ανάλυσης και το χρονόμετρο να
μπει σε λειτουργία μετά την πρόσθεση του τελευταίου δείγματος. Επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου
επί 30 λεπτά.
3
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Πλύση
Η διαδικασία πλυσίματος είναι καθοριστική και απαιτεί ειδική προσοχή. Μια πλάκα πλυμένη με λάθος
τρόπο, θα δώσει ανακριβή αποτελέσματα, με χαμηλή ακρίβεια και υψηλό υπόβαθρο. Μετά την επώαση,
αφαιρέστε την πλάκα και πλύνετε τα βυθίσματα 3 φορές με 200-300µL Πλυστικού Διαλύματος ανά
βύθισμα. Πλύνετε την πλάκα είτε σε συσκευή αυτόματης πλύσης, είτε με το χέρι με τον τρόπο που
περιγράφεται κάτωθι. Μετά την τελευταία αυτόματη πλύση, αναποδογυρίστε την πλάκα και τινάξτε τα
βυθίσματα, σε απορροφητικό χαρτί ώστε να στεγνώσουν.
Οι συσκευές αυτόματου πλυσιμάτος μικροπλακών δεν πρέπει να προγράμματίζονται για
μούλιασμα της πλάκας.
Οι πλάκες μπορεί να πλυθούν με το χέρι ως ακολούθως:
α.
Χτυπήστε ελαφρά ώστε να αδειάσουν τα περιεχόμενα της πλάκας μέσα στο νεροχύτη.
β.
Ταμπονάρετε τα βυθίσματα σε απορροφητικό χαρτί.
γ.
Γεμίστε κάθε βύθισμα με 200-300µL Πλυστικού Διαλύματος με πολυικάναλη πιπέττα.
δ.
Κινήστε ήπια την πλάκα σε επίπεδη επιφάνεια.
ε.
Επαναλάβατε a-d δύο φορές.
φ.
Επαναλάβατε a και b.
Μην αφήνετε το πλυστικό διάλυμα στα βυθίσματα για περισσότερο χρόνο από όσο απαιτείται για
να γεμίσει ολόκληρη η μικροπλάκα.
Πρόσθεση αντιδραστηρίου συζεύγματος
Διανείμετε 100µL αντιδραστηρίου συζεύγματος σε κάθε βύθισμα, σκουπίζοντας το άνω μέρος των
βυθισμάτων για να αφαιρεθούν τυχόν σταγονίδια. Σημείωση: Προς αποφυγή μόλυνσης, ποτέ μην
επιστρέφετε περίσσιο αντιδραστήριο συζεύγματος στη φιάλη του αντιδραστηρίου.Επωάστε σε
θερμοκρασία δωματίου επί 30 λεπτά.
Πλύση
Επανάληψη σταδίου 2.
Πρόσθεση υποστρώματος (TMB)
Διανείμετε 100µL υποστρώματος TMB σε κάθε βύθισμα, σκουπίζοντας το άνω μέρος των βυθισμάτων, για
να αφαιρεθούν τυχόν σταγονίδια. Σημείωση: Προς αποφυγή μόλυνσης, ποτέ μην επιστρέφετε περίσσιο
TMB στη φιάλη του αντιδραστηρίου. Επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου, στο σκοτάδι, επί 30 λεπτά.
Διακοπή
Διανείμετε 100µL διαλύματος διακοπής της αντίδρασης σε κάθε βύθισμα. Αυτό προκαλεί μια αλλαγή στο
χρώμα από μπλε σε κίτρινο.
Μέτρηση οπτικής πυκνότητας
Διαβάστε την οπτική πυκνότητα (ΟΠ) κάθε βυθίσματος στα 450nm σε συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας,
μέσα σε 30 λεπτά από την στιγμή διακοπής της αντίδρασης.
Έλεγχος ποιότητας
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Ποιοτικός έλεγχος
Για να είναι μια ανάλυση έγκυρη, όλα τα παρακάτω κριτήρια πρέπει να πληρούνται:
• Σε κάθε ανάλυση πρέπει να συμπεριλαμβάνονται τα αντιδραστήρια βαθμονόμησης, ο οριακός ορός
ελέγχουl(όταν το επιλέγει ο χρήστης) και ο αρνητικός και θετικός ορός ελέγχου.
• Οι αποκτώμενες τιμές για τον αρνητικό και θετικό ορό ελέγχου πρέπει να κυμαίνονται στο εύρος που
έχει καθοριστεί στο Πιστοποιητικό Ποιοτικού Ελέγχου.
• Μόνο για την Ποσοτική μέθοδο: Η μορφή της καμπύλης πρέπει να είναι παρόμοια με την καμπύλη
βαθμονόμησης, όπως αυτή φαίνεται στο Πιστοποιητικό Ποιοτικού Ελέγχου.
Αν τα ανωτέρω κριτήρια δεν πληρούνται, η ανάλυση είναι άκυρη, και η εξέταση πρέπει να
επαναλαμβάνεται.
Υπολογισμός της μέσης οτικής πυκνότητας (Για αναλύσεις που γίνονται εις διπλούν)
Για κάθε αντιδραστήριο, ορό ελέγχου και δείγμα υπολογίστε την μέση ΟΠ από τις δύο μετρήσεις. Ο
ποσοστιαίος συντελεστής διακύμανσης (%C.V.) για κάθε μια από τις διπλές αναλύσεις ΟΠ πρέπει να είναι
λιγότερο από 15%.
Σχεδιασμός της καμπύλης βαθμονόμησης
Η καμπύλη βαθμονόμησης μπορεί να σχεδιαστεί είτε αυτόματα είτε με το χέρι, αντιστοιχίζοντας την
συγκέντρωση του αυτοαντισώματος κατά dsDNA πάνω στον λογαριθμικό άξονα έναντι της ΟΠ στoν
γραμμικό άξονα για κάθε αντιδραστήριο βαθμονόμησης.
• Αυτόματο- Χρησιμοποιήστε κατάλληλα βαθμονομημένο λογισμικό, και την καμπύλη που ταιριάζει
περισσότερο στα δεδομένα.
• Με το χέρι- Χρησιμοποιώντας ημιλογαριθμικό χαρτί γραφιικών παραστάσεων, σχεδιάζετε μια καμπύλη
γραμμή η οποία να διέρχεται από τα σημεία (όχι μια ευθεία γραμμή από σημείο σε σημείο).
Χειρισμός ανώμαλων σημείων
Εάν κάποιο από τα σημεία δεν κείται επάνω στην καμπύλη, μπορεί να αφαιρεθεί. Εάν η απουσία αυτού του
σημείου επιφέρει στην καμπύλη σχήμα διαφορετικό από αυτό της καμπύλης βαθμονόμησης του δείγματος,
ή περισσότερα από ένα σημείο φαίνεται να είναι ανώμαλο, τότε η ανάλυση πρέπει να επαναληφθεί.
Υπολογισμός των επιπέδων αυτοαντισώματος στους ορούς ελέγχου και στα αραιωμένα δείγματα
Διαβάστε τα επίπεδα του αυτοαντισώματος κατά dsDNA, στους ορούς ελέγχου και τα αραιωμένα δείγματα
απ’ ευθείας από την καμπύλη βαθμονόμησης. Οι τιμές, θα πρέπει να εμπίπτουν στο εύρος που δίνεται, στο
Πιστοποιητικό Ελέγχου Ποιότητας. Σημειωση: Οι τιμές των βαθμονομητών έχουν προσαρμοστεί με βάση
τον παράγοντα 100 της αραίωσης δείγματος 1:101. Δεν απαιτείται καμία περαιτέρω διόρθωση στις τιμές
των δειγμάτων.
Βαθμονόμηση ανάλυσης
6
Η ανάλυση βαθμονομείται σε IU/mL έναντι της ΠΟΥ παρασκευής αναφοράς κατά Wo80 .
Περιορισμοί της Διαδικασίας
1.
Η μέθοδος αυτή χάρη στην ικανότητά της να ανιχνεύει μόνο αντισώματα υψηλής συνάφειας έναντι ds-DNA
μπορεί να μην είναι σε θέση να εντοπίσει ορισμένους τύπους ΣΕΛ όπου οι ασθενείς έχουν μόνο
αντισώματα χαμηλής συνάφειας. Είναι δυνατό να μη μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε εφαρμογές όπου
απαιτείται μέτρηση ολικών αντισωμάτων έναντι ds-DNA.
4
2.
3.
Το Διαγνωστικό αυτό Σύνολο χρησιμοποιείται μόνο για να βοηθήσει την διάγνωση. Ένα θετικό αποτέλεσμα
μπορεί να είναι ένδειξη κάποιων νόσων, οι οποίες πρέπει να επιβεβαιώνονται από κλινικά ευρήματα και
άλλες ορολογικές εξετάσεις.
Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης δεν συνιστούν αποδεικτικό στοιχείο ύπαρξης ή απουσίας της νόσου.
Αναμενόμενες Τιμές
Τα παρακάτω εύρη τιμών έχουν προσδιοριστεί με βάση αποτέλεσματα που προέκυψαν από δείγματα υγειών
αιμοδοτών (n=150) και ασθενών με ΣΕΛ (n=224) τα οποία εξετάστηκαν με το FARRZYME:
ΕΡΜΗΝΕΙΑ
Αρνητικό αποτέλεσμα
≤ 30 IU/mL
> 30 IU/mL
Θετικό αποτέλεσμα
Οι 150 οροί των φυσιολογικών αιμοδοτών έδωσαν αποτελέσματα κάτω από 17,0 IU/mL με 146 (97%) των
αποτελεσμάτων κάτω από 12,3 IU/mL το οποίο αποτελεί και το χαμηλότερο όριο ανίχνευσης του ΚΙΤ. Το 22,8%
των ορών ασθενών ΣΕΛ έδωσε θετικα αποτελέσματα σε FARRZYME (>30 IU/mL).
Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται πιο κάτω είναι μια σύγκριση ανάμεσα στα 224 δείγματα ΣΕΛ που
μελετήθηκαν με FARRZYME και με συμβατική ELISA έναντι ds-DNA η οποία ανιχνεύει τοσο χαμηλής όσο υψηλής
συνάφειας αντισώματα έναντι ds-DNA.Τα δείγματα που έδωσαν οριακά αποτελέσματα στη συμβατική ELISA
θεωρήθηκαν ως αρνητικά όταν υπολογίστηκε το ποσοστό συμφωνίας στα θετικά και στα αρνητικά καθώς και το
ποσοστό συμφωνίας στο σύνολο.
Συμβατικές ELISA ds-DNA
Θετικό Όριο
Αρνητικό
Θετικό
47
3
1
FARRZYME
Αρνητικό
33
51
89
Ποσοστό συμφωνίας θετικών: 58,8%
Ποσοστό συμφωνίας αρνητικών: 97,2%
Ποσοστό συμφωνίας συνολικά: 83,5%
Η συχνότητα εμφάνισης αντισωμάτων υψηλής συνάφειας που ανιχνεύτηκε με FARRZYME και με FARR RIA σε 100
8
ασθενείς ΣΕΛ αναφέρθηκε να είναι 36% και 38% αντίστοιχα . Σε αντίθεση σε 100 ασθενείς με διάφορα νοσήματα
συνδετικού ιστού και άλλα αυτοάνοσα νοσήματα η συχνότητα εμφάνισης ήταν 4% και 5% για τις δυο μεθόδους
αντίστοιχα.
Οι τιμές που λήφθηκαν με την ανάλυση FARRZYME μπορεί να μην συμφωνουν με εκείνες που ελήφθησαν από
άλλες αναλύσεις με αναφορά σε IU/mL, καθώς αυτή η ανάλυση μετράει το υψηλής συνάφειας υποσύνολο του
αυτοαντισώματος κατά dsDNA.
Τα εύρη παρέχονται μόνο ως οδηγός. Οι αναλύσεις ELISA είναι πολύ ευαίσθητες και ικανές να εντοπίζουν μικρές
διαφορές στους πληθυσμούς δειγμάτων. Συνιστάται, κάθε εργαστήριο να προσδιορίζει το δικό του φυσιολογικό
εύρος, βάσει του πληθυσμού, της τεχνικής και του εξοπλισμού που χρησιμοποιείται.
ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ
1.
ΕΥΡΟΣ ΜΕΤΡΗΣΗΣ
Το εύρος μέτρησης της ανάλυσης είναι 12,3 – 1000 IU/mL.
2.
ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ
Η επιβεβαίωση ότι η μέθοδος FARRZYME μπορεί να διαχωρίσει δύο δείγματα με τιμές κοντά στο κατώτερο
όριο του εύρους μέτρησης (120 και 165% του χαμηλότερου αντιδραστηρίου βαθμονόμησης) επετεύχθη με
στατιστική ανάλυση (Student’s t-test) των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από την εξέταση του ίδιου
δείγματος πολλές φορές.
3.
ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ, ΣΥΜΦΩΝΙΑ
189 δείγματα από ασθενείς με ΣΕΛ, μαζί με 35 δείγματα θετικά για αντισώματα ds DNA με Crithidia ή
ELISA και 28 δείγματα από υγιή άτομα εξετάστηκαν με Farrzyme, με Crithidia luciliae μέθοδο
ανοσοφθορισμού και με συμβατική μέθοδο ELISA ds DNA.
CRITHIDIA IFA
+
+
37
14
FARRZYME
18
183
Ποσοστό συμφωνίας θετικών
67,3%
Ποσοστό συμφωνίας αρνητικών
92,9%
Ποσοστό συμφωνίας επί του συνόλου
87,3%
Το FARRZYME EIA έδειξε καλή συμφωνία στα ποσοστά των αρνητικών με τη μέθοδο ανοσοφθορισμού
Crithidia lucilae. Η συμφωνία ωστόσο στο ποσοστό των θετικών μειώθηκε επειδή η δεύτερη μεθοδος είναι
11
γνώστο ότι ανιχνεύει αντισώματα anti-DNA χαμηλής συνάφειας σε αντίθεση με τη μέθοδο FARRZYME.
Συμβατική dsDNA ELISA
+
Οριακά
+
47
3
1
FARRZYME
33
51
117
*Ποσοστό συμφωνίας θετικών
58,8%
Ποσοστό συμφωνίας αρνητικών
97,7%
Ποσοστό συμφωνίας επί του συνόλου
85,3%
* Για τον υπολογισμό της συμφωνίας μεταξύ των δύο μεθόδων, τα δείγματα που βρίσκονταν στην οριακή περιοχή
της συμβατικής dsDNA ELISA θεωρήθηκαν αρνητικά. Η συμβατική ELISΑ ανιχνεύει αντισώματα τόσο υψηλής όσο
και χαμηλής συνάφειας με αποτέλεσμα τη χαμηλότερη συμφωνία στο ποσοστό των θετικών για τη μεθοδο
FARRZYME.
5
4.
ΟΥΣΙΕΣ ΠΟΥ ΠΑΡΕΜΒΑΙΝΟΥΝ
Αναλύθηκαν διάφοροι τύποι ορών, για να εξεταστεί η πιθανή επίδραση ουσιών που παρεμβαίνουν
χρησιμοποιώντας ένα διαγνωστικό σύνολο Interference Check A plus (Kokusai, Ιαπωνία).
Ουσία
Χολερυθρίνη F (Ελεύθερη)
Χολερυθρίνη C (Συζευγμένη)
Αιμολυμένη Αιμοσφαιρίνη
Χολή
Ρευματοειδής παράγοντας
Συγκέντρωση
20,3mg/dL
20,2mg/dL
486mg/dL
1460 Units
45 IU/mL
Καμμιά παρέμβαση δεν παρατηρήθηκε με ελεύθερη ή συζευγμένη μπιλιρουμπίνη, αιμοσφαιρίνη, λιπίδιο ή
ρευματοειδή παράγοντα.
Σε μια διαφορετική μελέτη, εξετάστηκαν 6 οροί με μυέλωμα IgG με τη μέθοδο FARRZYME και κανένας από
αυτούς δεν έδωσε θετικό αποτέλεσμα.
5.
ΑΚΡΙΒΕΙΑ
Μετρήθηκαν η ακρίβεια ενδοανάλυσης και η ακρίβεια μεταξύ αναλύσεων με την χρήση έξι δειγμάτων μέσα
στο εύρος της καμπύλης βαθμονόμησης. Ο μέσος όρος και το %CV για κάθε δείγμα, δίνονται παρακάτω:
Η Ακρίβεια Ενδοανάλυσης μετρήθηκαν με την χρήση 20 επαναλήψεων σε μια ανάλυση.
n=20
Δείγμα 1
Δείγμα 2
Δείγμα 3
Δείγμα 4
Δείγμα 5
Δείγμα 6
ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΕΝΔΟΑΝΑΛΥΣΗΣ
Συγκέντρωση (IU/mL)
25,1
39,0
74,5
205,5
361,2
528,6
%CV
5,4
4,8
2,2
3,3
4,3
5,1
Η Ακρίβεια μεταξύ αναλύσεων μετρήθηκε δοκιμάζοντας δείγματα εις διπλούν σε 6 αναλύσεις σε 3 ξεχωριστές μέρες.
ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΜΕΤΑΞΥ ΑΝΑΛΥΣΕΩΝ
n=6
Συγκέντρωση (IU/mL)
Δείγμα 1
24,6
Δείγμα 2
42,3
Δείγμα 3
61,3
Δείγμα 4
123,2
Δείγμα 5
272,4
Δείγμα 6
474,1
%CV
13,5
3,9
11,6
4,9
7,0
6,9
ΣΧΕΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΠΛΑΚΑΣ
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
Γ
Δ
E
Φ
Γ
Χ
Περίληψη της διαδικασίας
1.
Προσθέστε 100µL κάθε αντιδραστηρίου, ορού ελέγχου και αραιωμένου δείγματος 1:101 στα κατάλληλα
βυθίσματα.
Επωάστε επί 30 λεπτά.
Πλύνετε.
2.
Προσθέστε 100µL αντιδραστηρίου συζεύγματος σε κάθε βύθισμα.
Επωάστε επί 30 λεπτά.
Πλύνετε.
3.
Πρόσθεση 100µL υποστρώματος σε κάθε βύθισμα.
Επωάστε επί 30 λεπτά.
4.
Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης σε κάθε βύθισμα.
Μετρήστε την απορρόφηση στα 450nm.
QUANTA Lite και INOVA Diagnostics είναι σήματα κατατεθέντα.Copyright 2012 All Rights Reserved©
6
Βιβλιογραφία
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Isenberg D and Smeenk R. Clinical laboratory assays for measuring anti-dsDNA antibodies. Where
are we now? Lupus, 2002; 11: 797-800.
Ceppelini R, Polli E and Celada F. A DNA-reacting factor in serum of a patient with lupus erythematosus
diffuses. Proc Soc Exp Biol Med, 1957; 96: 572-574.
Tan et al. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis
Rheumatism, 1982; 25:1271-7.
Riboldi P et al. Anti-DNA antibodies: a diagnostic and prognostic tool for systemic lupus erythematosus?
Autoimmunity. 2005; 38: 39-45.
Werle E et al. The clinical significance of measuring different ant-dsDNA antibodies by using the Farr
assay, an enzyme immunoassay and a crithidia luciliae immunofluorescence test. Lupus, 1992; 1: 369-377.
Isenberg D. Anti-dsDNA antibodies: still a useful criterion for patients with systemic lupus erythematosus?
Lupus, 2004; 13: 881-885.
Nossent H C and Rekvig O P. Is closer linkage between systemic lupus erythematosus and anti-doublestranded DNA antibodies a desirable and attainable goal? Artheritis Res Ther, 2005; 7(2): 85-7.
Jaekel HP et al. Anti-dsDNA antibody subtypes and anti-C1q antibodies: toward a more reliable diagnosis
and monitoring of systemic lupus erythematosus and lupus nephritis. Lupus, 2006; 15:
1-11.
Renaudineau Y et al. Association of α-actinin-binding anti-dsDNA antibody Protein Reference Unit
Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A with lupus nephritis. Arthritis Rheumatism, 2006 (in
press)
Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD
Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
Smeenk R, van der Lelij G and Aarden L. Measurement of low avidity anti-dsDNA by the Crithidia
luciliae test and the PEG assay. Clin Exp Immunol, 1982; 49: 603-610.
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of
Health, 2007, Fifth Edition.
Κατασκευαστής:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
United States of America
Technical Service (U.S. & Canada Only) :
877-829-4745
Technical Service (Outside the U.S.) : 00+ 1 858-805-7950
support@inovadx.com
Aντιπροσωπευτικός:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
Altenhofstrasse 80
D-66386 St. Ingbert, Germany
Tel.: +49-6894-581020
Fax.: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
624615GRC
August 2012
Revision 3
7

Download Report