La rabbia: epidemiologia e diagnosi di laboratorio Franco Mutinelli Centro di referenza nazionale per la rabbia Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie E-mail: fmutinelli@izsvenezie.it Riccione, 23 maggio 2014 Cos’è la rabbia La rabbia è una zoonosi, causata da un virus appartenente alla famiglia Rhabdoviridae, genere Lyssavirus. Colpisce animali selvatici e domestici e si può trasmettere all’uomo e ad altri animali attraverso il infetti. La malattia sviluppa una encefalite ed una volta che i sintomi della malattia si manifestano, la rabbia ha ormai già un decorso fatale sia per gli animali sia per l’uomo. Il cane, per il ciclo urbano, e la volpe, per il ciclo silvestre, sono attualmente gli animali maggiormente interessati sotto il profilo epidemiologico. Tassonomia del virus della rabbia Virus species Potential vector/reservoir Distribution Rabies virus (type species) Carnivores (worldwide); bats (Americas) Lagos bat virus Mokola virus ? Frugivorous bats (Megachiroptera) (isolated from Shrews) Duvenhage virus Insectivorous bats European bat lyssavirus 1 European bat lyssavirus 2 Australian bat lyssavirus Aravan virus Insectivorous bats (Eptesicus serotinus) Insectivorous bats (Myotis daubentonii, M. dasycneme) Frugivorous/insectivorous bats (Megachiroptera/Microchiroptera) Insectivorous bats (Myotis blythi) Insectivorous bats (Myotis mystacinus) Insectivorous bats (Murina leucogaster) Insectivorous bats (Miniopterus schreibersi) Hipposideros commersoni Insectivorous bats (Myotis nattereri) (isolated from Civettictis civetta) Worldwide (except several islands) Sub-Saharan Africa Sub-Saharan Africa Sub-Saharan Africa Europe Khujand virus Irkut virus West Caucasian bat virus Shimoni bat virus Bokeloh bat lyssavirus* Ikoma lyssavirus* ? *not yet approved by ICTV Europe Australia Central Asia Central Asia East Siberia Caucasian region East Africa Europe Africa Tassonomia • Ordine: Mononegavirales • Famiglia: Rhabdoviridae • Genere: Lyssavirus • • • • • • • • Genoma RNA a singola elica, simmetria elicoidale con 30-35 spire, non segmentato, 12 kb, polarità negativa, 5 proteine (N, P, L, G, M) P dimensioni 75 X 180 nm RNA associato ad una nucleoproteina N, resistente alla putrefazione Presenza di envelope lipoproteico Phylogenetic tree of Rhabdoviridae based on the alignment of partial nucleoprotein (N) gene sequences (1027 nucleotides) Unrooted phylogenetic trees based on the entire lyssavirus N gene nucleotide sequences (a) and glycoprotein ectodomain amino acid sequences (b) (Kuzmin et al., 2005). Gruppo filogenetico I Gruppo filogenetico II Gruppo filogenetico III Cross-reattività antigenica del nucleocapside Elevata conservazione della proteina N Identità aminoacidica dal 78% (MOKV e EBLV-2) al 93% (DUVV e EBLV-1) Possibilità di utilizzare gli stessi reagenti per la diagnosi con FAT Cross-reattività antigenica dell’ectodominio della proteina G Maggiore variabilità Cross-reattività solo fra lyssavirus dello stesso gruppo filogenetico (identità AA >74%) Diverso gruppo filogenetico (identità AA <62%) Ceppi vaccinali (tutti genotipo 1, gruppo filogenetico I) non protettivi verso lyssavirus del gruppo filogenetico II Rischio di trasmissione della rabbia Situazione della rabbia Rabbia silvestre e rabbia urbana • Reservoir = animale selvatico • In Europa è la volpe Reservoir = cane Europa 1977 - 2013 1977: 1984: 1989: 1994: 1999: 2001: 2002: 2003: 2004: 2005: 2006: 2007: 2008: 2009: 2010: 2011: 2012: 2013: 16821 casi 23625 24377 8820 6591 10435 10051 11085 5452 9830 9172 13293 9707 6708 7471 5803 5947 2820 (2 trimestre 2013) www.who-rabies-bulletin.org Diffusione dell’infezione rabida: 1938-1988 1989 2° trimestre 2013 (1143 casi) 1143 casi: selvatici 428; domestici (694 domestici, 1038 = selvatici, 0 pipistrelli,=2 705; uomo)pipistrelli = 7; uomo = 3 Rabbia dei pipistrelli insettivori in Europa Casi di rabbia di importazione (cane) in Europa Year Country of diagnosis Country of origin 1979 1984 1984 The Netherlands Portugal Italy India Mozambique Yugoslavia 1988 1989 1991 1992 1995 1997 1999 2001 2002 2004 2007 2007 2008 2008 2008 2008 2009 2010 2011 2012 2013 Switzerland Italy France Italy France Switzerland Austria France Germany France Belgium Finland France UK (under quarantine) Belgium, France Germany == == France The Netherlands Spain Zaire Ivory Coast Mexico Hungary Burkina Faso Morocco Turkey Morocco Azerbaijan Morocco Morocco India Morocco Sri Lanka Gambia Croatia == == Morocco Morocco Morocco Rabbia in Italia Bellani et al., 1976 Rabbia silvestre in Italia Ultimo caso: dicembre 1995 Indenne da rabbia dal 1997 Nuovi casi di rabbia nella volpe-ottobre 2008 17 ottobre 2008 Comune: Resia (UD) Località: Oseacco 1 volpe rabida (abbattuta) 27 ottobre 2008 Comune: Venzone (UD) 1 volpe rabida (trovata morta) Slovenia: casi di rabbia nel 2008 = 55 (51 volpi, 2 tassi, 1 cane, 1 cavallo) Slovenia: casi di rabbia nel 2009 = 34 (33 volpi, 1 bovino) WE Albero filogenetico del gene della nucleoproteina del virus della rabbia isolato da volpe in Italia, ottobre 2008 CE EE NEE VAC (De Benedictis et al., 2008) Sintesi dei casi di rabbia: 2008-2011 Nel 2011: una volpe trovata morta il 14 febbraio Raccolta e invio dei campioni al laboratorio Anamnesi Storia Comportamento Aggressività Contatto-morsicatura Altre informazioni disponibili Da dove si comincia ………. Aspetti clinici • Sintomatologia nervosa Fase prodromica: • • dopo un periodo di incubazione segue la comparsa dei sintomi, 1-3 giorni: minimi cambiamenti comportamentali, aggressività in alcuni casi, attività durante il giorno in animali crepuscolari, perdita di paura nei confronti dell’uomo o disturbi dell’appetito Fase eccitativa (furiosa): • • fase di forte agitazione e aggressività. Morsicatura di oggetti, modifica nel suono emesso abbaiando, morte dopo convulsioni, anche senza la fase paralitica. Fase paralitica: incapacità di deglutire con formazione di schiuma attorno alla bocca. Paralisi del posteriore. Paralisi seguita da morte. Strumenti Apertura della scatola cranica Apertura della scatola cranica Campioni da prelevare Corteccia cerebrale, corno d’Ammone, cervelletto, midollo allungato ghiandole salivari Campionamento da cervello mediante pipetta Foro occipitale (Foramen magnum) Forame ottico Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test (Bingham & van der Merwe, 2002; Journal of Virological Methods 101, 85-94) The antigen quantity scores for all specimens by different regions of the brain, recorded as percentage of total samples tested Conservazione dei campioni Catena del freddo (4°C, -20°C) Rapida consegna al laboratorio 50% glicerina e PBS: campione di cervello prelevato e conservato senza refrigerazione è ancora analizzabile per l’RNA virale dopo 60 gg. (Aguyilar-Setién et al., 2003) Diagnosi di laboratorio Metodiche ufficiali Nucleoproteina Immunofluorescenza diretta Isolamento del virus su coltura cellulare di neuroblastoma di topo Isolamento del virus da topo Virus Diagnosi di laboratorio Metodiche ufficiali Immunofluorescenza diretta (FAT) Nucleoproteina Rapid tissue culture inoculation test (RTCIT) Caratteristiche del metodo: • Cellule di neuroblastoma murino • Risultati dopo 24-72 ore • Sensibilità dipende dal ceppo in esame • 0.5*10^2.5 TCID/ml calcolata su virus adattato a cellule Limiti: 1. Anticorpo coniugato con FITC 2. Conservazione della carcassa e dei campioni Positive 200x magnification RTCIT mouse neuroblastoma cells Negative 200x magnification IZSVe Rapid tissue culture inoculation test (RTCIT) RTCIT vs Mice inoculation test Etici Tempi d risposta Sensibilità Istologia: corpi del Negri L’OMS ne sconsiglia l’utilizzo Immunoistochimica direct Rapid Immunohistochemistry test – dRIT A. Positive 200x magnification IZSVe B. Positive 200x magnification A. direct rapid immunohistochemistry test (DRIT). B. fluorescent antibody test (FAT). IZSVe Microscopia elettronica Diagnosi di laboratorio Altre metodiche RNA virale real time RT-PCR one-step RT-PCR con primer specifici sequenziamento Sequencing of the gene coding for the nucleoprotein, glicoprotein and G-L intergenic portion Virus typing WE Utile per: • circolazione transfrontaliera degli animali selvatici CE • importazione illegale NE • spill-over di lyssavirus dal reservoir selvatico 2003, 2007) NEE VAC Biomolecular methods for rabies diagnosis Opinion of the international organizations OIE Manual of Diagnostic Tests (2008): “…The identification of the agent can be supplemented in specialised laboratories by identifying any variant virus strains through the use of monoclonal antibodies, specific nucleic acid probes, or the polymerase chain reaction followed by DNA sequencing of genomic areas. Such techniques can distinguish between field and vaccine strains, and possibly identify the geographical origin of the field strains…” WHO Expert Consultation on rabies (2005): “ …The use of PCR and other amplification techniques is not currently recommended for routine post-mortem diagnosis of rabies. However, these molecular techniques can be applied for epidemiological surveys in laboratory with strict quality control procedures in place and that have experience and expertise with these techniques…” 5): Tecniche di biologia molecolare Utili per: - Tipizzazione virale - Effetti collaterali della vaccinazione orale delle volpi (ORV) - Test di conferma (in caso di FAT negativa) in campioni sospetti, animali domestici, animali morsicatori, esposizione a rischio - Diagnosi intra-vitam Diagnosi nell’uomo • Post mortem • Intra vitam: • RT-PCR su sangue, saliva, liquor, biopsia nucale Clinical Infectious Diseases 2008; 47: 14101417 Titolazione degli anticorpi (FAVN test) Verifica della risposta immunitaria dopo la vaccinazione Laboratorio riconosciuto dall’UE Il test non ha valenza diagnostica Laboratorio e campagna di vaccinazione orale delle volpi Monitoraggio FAVN test su coagulo di volpi raccolte 30 gg. dopo la fine della distribuzione delle esche (8 volpi/100 km2) Ricerca della tetraciclina nell’osso (mandibola) come marker di assunzione dell’esca Informazione • RABIES BULLETTIN EUROPE, 1977-…. : www.who-rabies-bulletin.org • WHO Expert Consultation on Rabies, Second Report, 2013 WHO Technical Report Series 982 • EFSA SCIENTIFIC REPORT Development of harmonised schemes for monitoring and reporting of rabies in animals in the European Union: www.ec.efsa.eu • • RABNET, 1998: www.who.ch WHO, Division for Emerging and other Communicable Diseases Surveillance and Control, Zoonotic Disease Unit • Center for Disease Control and Prevention: www.cdc.gov • The World Rabies Day web site: www.worldrabiesday.org www.izsvenezie.it
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