MiSeq® 試薬キット v2 試薬調製ガイド FOR RESEARCH USE ONLY Revision History (改 訂 履 歴 ) 3 MiSeq Reagent Kits (試 薬 キット ) 4 Kit Contents and Requirements (キット の内 容 物 およ び要 件 ) 6 Flow Cell Types (フローセルタイプ) 8 ソフト ウェアおよびフローセルの互 換 性 9 Reagent Cartridge Overview (試 薬 キット の概 要 ) 10 Preparing Reagents (試 薬 の準 備 ) 12 What's Next (次 の手 順 ) 14 Technical Assistance (テクニカルサポート ) ILLUMINA PROPRIETARY パーツ番 号 15034097_JPN 改 訂 B 2012 年 10 月 本書および本書の内容は Illumina, Inc. (Illumina) が所有権を有する知的財産であり、顧客が契約の下で使用する ことを意図した ものです。本書 に記載されたシ ステムの操作 以外の目的での使用は意図されていません。Illumina の事前の書 面による許 可なく、目的 や方法を問 わず、本書お よびその内 容を使用ま たは配布、通 信、開示、ま た は複製することを禁じます。Illumina はこの文書によって、特許、商標、著作権、判例法における第三者の権利また は同様の権利のもと、いかなるライセンスも譲渡することはありません。 本システムやそのすべ ての構成部品が正常 に動作するためには、経験を積んだオペレー タが本書の手順に厳 密 かつ明示的に従う 必要があります。 本システムまたはその構成部品を操 作する前に、本書の内容を熟読し、完 全 に理解する必要があります。 本システムまたはその構成部品を操作する前に、本書の熟読や完全な理解を怠り、本書の記載に従わない場 合、 装置またはその部品が損傷したり、装置またはその部品を操作するオペレータが怪我をしたりする恐れがあります。 また、Illumina, Inc. は、その特許権、登録商標権、著作権、または慣習法上の権利もしくはその他の類似の権利の 下でのいかなる許諾 も付与しません。Illumina, Inc. は、予告なく、本書 に記載されたあらゆる手順、製品、またはそ の部品を変更する権利 を有します。発行日の時点で、本書の内容につ いては可能な限り完 全かつ正確であるよう に万全を期して おりますが、Illumina は保証または適 合性を黙示す るものではなく、本書に含まれる情報に起因 し て発生したいかなる損害についても一切責任を負いかねます。 © 2012 Illumina, Inc.All rights reserved. Illumina、illumina、Dx、BaseSpace、BeadArray、BeadXpress、cBot、CSPro、DASL、DesignStudio、Eco、GAIIx、 Genetic Energy、GenomeStudio、GoldenGate、HiScan、HiSeq、Infinium、iSelect、MiSeq、Nextera、NuPCR、Genome Analyzer、SeqMonitor、Solexa、TruSeq、VeraCode、パンプキンオレンジ 色、および Genetic Energy ストリー ミング ベースデザインは Illumina, Inc. の登録商 標または商 標です。ここに含まれるその他すべ てのブランドおよび名 称 の所有権はそれぞれの所有者に帰属します。 パーツ番号 改訂 日付 15034097_JPN B 2012 年 10 月 15034097 A 2012 年 7 月 MiSeq 試 薬 調 製 ガイド 変更の内容 次の情報を追加。 • MiSeq 試薬マイクロキット v2 および MiSeq 試薬ナ ノ キット v2 の説明 • マイクロとナノのフローセル、およびデータ出力に関 する説明 • ソフトウェアとフローセルの互換性 英語版のみ利用可能です。 初回リリース。 3 Revision History (改 訂 履 歴 ) Revision History (改 訂 履 歴 ) MiSeq Reagent Kits (試 薬 キット ) MiSeq でランを実行するに は、ラン 1 回に つき、使い切りの MiSeq 試薬キットが 1 つ必要で す (3 つのキットタイプから選択できる)。MiSeq 試薬キットの各タイプには、キットに固有のタイ プのフローセルと、1 度のランの実行に必要な試薬が含まれています。 キットタイプ フローセルタイプ 利用可能なキットサイズ MiSeq 試薬キット v2 標準 (14 タイル) フローセ ルを含む 500 サイクル 300 サイクル 50 サイクル MiSeq 試薬マイクロキット v2 マイクロ (4 タイル) フロー セルを含む 300 サイクル MiSeq 試薬ナノキット v2 ナ ノ (2 タイル) フローセ ルを含む 500 サイクル 300 サイクル キットに含まれているフローセル、PR2 ボトル、および試薬カートリッジでは、正確な消耗品の 追跡と互換性を確実にするために RFID (無線自動識別) を使用します。 フローセルタイプ に関連付けられている試薬カートリッジを使用しなければなりません。 試薬 カートリッジに互換性がない場合は、ラン セットアップ手順の際に メッセージが画面に表示さ れます。 互換性のある試薬カートリッジをロードしないとランが続行できません。 Reagent Kit Sizes (試 薬 キット のサイズ) 試薬キットのサイズは、1 つのキットを使用して実行で きるシーケンスサイクル数によって測定 されます。 可能なサイズには、500 サイクル、300 サイクル、および 50 サイクルがあります。 キットサイズ サイクル数 500 サイクル キッ ト 最大 525 サイクル のシーケンスが可能な試薬を提供します。これは 最大 251 サイクル のペア エンドラン、および 2 つの 8 サイクルのインデックスリードに十 分な試薬です。 4 パーツ番 号 15034097_JPN 改 訂 B サイクル数 300 サイクル キッ ト 最大 325 サイクル のシーケンスが可能な試薬を提供します。これは 最大 151 サイクル のペア エンドラン、および 2 つの 8 サイクルのインデックスリードに十 分な試薬です。 50 サイクルキット 最大 75 サイクルのシーケ ンスが可能な試薬を提供します。これは 最大 26 サ イクルのペアエンドラン、および 2 つの 8 サイクル のインデックスリードに十分 な試薬です。 MiSeqReagent Kit v2 (試 薬 キット v2) 消耗品 MiSeq試薬キット v2、500 サイクル MiSeq試薬キット v2、300 サイクル TG MiSeq 試薬キット v2、300 サイクル MiSeq試薬キット v2、50 サイクル カタログ番号 カタログ番号 MS-102-2003 カタログ番号 MS-102-2002 カタログ番号 TG-142-1003 カタログ番号 MS-102-2001 MiSeqReagent Micro Kit v2 (試 薬 マイクロキット v2) 消耗品 MiSeq 試薬マイクロキット v2、300 サイクル TG MiSeq 試薬マイクロキット v2、300 サイクル カタログ番号 カタログ番号 MS-103-1002 カタログ番号 TG-142-1002 MiSeqReagent Nano Kit v2 (試 薬 ナノキット v2) 消耗品 MiSeq 試薬ナノキット v2 (500 サイクル) MiSeq 試薬ナノキット v2 (300 サイクル) TG MiSeq 試薬ナノキット v2、300 サイクル MiSeq 試 薬 調 製 ガイド カタログ番号 カタログ番号 MS-103-1003 カタログ番号 MS-103-1001 カタログ番号 TG-142-1001 5 MiSeq Reagent Kits (試 薬 キット ) キットサイズ Kit Contents and Requirements (キット の内 容 物 および要 件 ) すべての MiSeq 試薬キットは 2 つの箱に 分かれて梱包されています。キットを受け取ったら、 適切な性能を保証する ため、速やかにそれぞれのキットコ ンポーネン トを指定の 温度で保管 します。 ボックス 1:-15° ～ -25 °C で保管 数量 1 コンポーネント 試薬カートリッジ 保管 -15°～ -25℃ 1 HT1 -15°～ -25℃ 説明 試薬が充填された使い切りのカートリッ ジ 5 ml チューブ、ハ イブリダイゼーション バッファー ボックス 2:2° ～ 8℃ で保管 数量 1 コンポーネント PR2 ボトル 保管 2°～ 8℃ 1 MiSeq フローセル 2°～ 8℃ 説明 500 ml ボト ル、イ ンコー ポレー ション バッファー 使い切りの PE フローセル Preparation Requirements (試 薬 の準 備 ) A B C 6 フローセル — 使用前に所定の手順に沿ってきれいにする 必要があ ります。詳細につい ては、『MiSeq システムユーザーガイド』、パーツ番号 15027617_JPN を参照してくださ い。 試薬カートリッジ — 使用前に解凍および目視で確認する必要があります。 PR2 ボトル — 調製のための操作は不要です。 パーツ番 号 15034097_JPN 改 訂 B Kit Contents and Requirements (キット の内 容 物 および要 件 ) D HT1 (表示なし) - 使用前に解凍され、氷冷されている必要があります。 MiSeq 試 薬 調 製 ガイド 7 Flow Cell Types (フローセルタイプ) フローセルは、クラスター形成とシーケンス反応が実行される、シングルレーン、ガラス製の 基 板です。 シーケン スラン中に、フローセルのシングルレーンは、「タイル」と呼ばれる 小さなイ メージング領域単位ごとにイメージ化されます。 フローセルは、フローセル専用容器内に 入れられた状態で 届き ます。 フローセル容器の キャップの色によって、フローセルタイプがわかるようになっています。 } 透明のキャップ: 標準 (14 タイル) フローセルに対するキャップの色。 } 緑色のキャップ: マイクロ (4 タイル) フローセルに対するキャップの色。 } 黄色のキャップ: ナノ (2 タイル) フローセルに対するキャップの色。 フローセルタイプに よって、イメージ化される タイルの アウ トプットと数が異なり ます。 標準フ ローセルおよびマイクロフローセルで可能なデュアルサーフェースイメージングでは、イメージ 化されるタイルの数が 2 倍になります。 フローセルのアウトプットは、各フローセルから取得可能なリードの数によって異なります。 リー ドは、フィルターをパスしたクラスターの数として測定されます。 Flow Cell Tiles (フローセルのタイル) フローセル 標準フローセル マイクロフローセル ナノフローセル タイル 14 タイル 4 タイル 2 タイル イメージングサーフェース 上面と底面 上面と底面 上面のみ イメージ化されるタイルの合計 合計 28 タイル 合計 8 タイル 合計 2 タイル Flow Cell Output (フローセルのアウト プット ) フローセル 標準フローセル マイクロフローセル ナノフローセル 8 リー ド数 15 M 4M 1M キット サ イズ (サイクル) 50, 300, 500 300 300, 500 ア ウト プッ ト (最大) 7.5 Gb 1.2 Gb 500 Mb 2 x 75 ア ウトプット 2.25 Gb 600 Mb 150 Mb 2 x 150 ア ウトプット 4.5 Gb 1.2 Gb 300 Mb 2 x 250 ア ウトプット 7.5 Gb -500 Mb パーツ番 号 15034097_JPN 改 訂 B 表記載以前のバージョンのMiSeq Control Software (MCS)は、マイクロやナノのフローセルに 対応で きません。さらに、表記載以前のソフトウェアは 14 タイルではなく 12 タイルを標準フ ローとしてイメージ化します。 フローセルの RFID を読み取り、タイル数やイメージ化する表面を適切に決定するために は、 互換性がある MCS のバージョンを使用する必要があります。 フローセル 必要な MCS バージョン 標準フローセル MCS v2.0 以降 マイクロフローセル MCS v2.1 以降 ナノフローセル MCS v2.0 以降 デュアルサーフェースフローセルイメージングの要件を含む詳細は、MiSeq システムユーザー ガイドの「バージョンの互換性および要件」(パーツ番号 15027617_JPN) を参照してください。 MiSeq 試 薬 調 製 ガイド 9 ソフト ウェアおよびフローセルの互 換 性 ソフト ウェアおよびフローセルの互 換 性 Reagent Cartridge Overview (試 薬 キット の概 要) MiSeq 試薬カートリッジは使い切りの消耗品で、ホイルシールで密閉されたリザーバーで構成 されます。リザーバーに は、1 つの フローセルをシーケンスするの に十分なクラスター試薬と シーケンス試薬があらかじめ充填されています。カートリッジの各リザーバーに は、番号が 付 けられています。 シーケンスランの開始前に、サンプルライブ ラリーをカートリッジの位置 17 (「Load Samples」 と いうラベルが付いている) にロードします。 図 1 試薬カートリッジ 表 1 試薬カートリッジの内容物 位置 試薬名 1 IMS 2 SRE 10 説明 インコーポレーションミックス スキャンミックス パーツ番 号 15034097_JPN 改 訂 B 試薬名 CMS AMS1 AMS2 LPM LDR LMX1 LMX2 RMF HP10 HP12 HP11 PW1 PW1 空 空 説明 クリーベージミックス アンプリフィケーションミックス、リード 1 アンプリフィケーションミックス、リード 2 リニアライゼーションプレミックス ホルムアミド リニアライゼーションミックス リード 2 リニアライゼーションミックス リシンセシスミックス リード 1 プライマーミックス インデックスプライマーミックス リード 2 プライマーミックス ラボラトリーグレード水 ラボラトリーグレード水 Load Samples (サンプルライブラリー用に確保) カスタムリード 1 プライマーに対してオプションで使用 19 空 20 空 カスタムインデックスリードプライマーに対してオプ ションで使用 カスタムリード 2 プライマーに対してオプションで使用 21 22 PW1 空 ラボラトリーグレード水 空 Reagent Cartridge Overview (試 薬 キット の概 要 ) 位置 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 注意 MiSeq 試薬カートリッジでのカ スタムプライマーの使用に関する 詳細については、 『 MiSeq System User Guide (MiSeq シ ス テ ム ユー ザー ガ イ ド) 』、 パー ツ 番 号 15027617_JPN を参照してください。 MiSeq 試 薬 調 製 ガイド 11 Preparing Reagents (試 薬 の準 備 ) 次の手順で、室温の 水槽内で 試薬を解凍させる 方法を説明します。 この操作には約 1 時間 かかります。 注意 2° ～ 8 °C の冷蔵庫で一晩かけて試薬を解凍することもできます。 試薬は この温 度で保管すると、1 週間まで安定しています。 1 -15° ～ - 25 °C の冷凍庫から HT1 (ハイブリダイゼーションバッファー) のチューブ を 取り出し、解凍するために室温に置いたままに します。 解凍したら、変性されたライブ ラ リーを希釈する準備が できるまで 2°～ 8 °C で保管します。 (この手順は TruSeq アン プリコンのライブラリーには必要ありません。) 詳細については、『 MiSeq システムユーザーガイド 』、パーツ番号 15027617_JPN を参照 してください。 2 -15 ～ -25 °C の保管庫から試薬カートリッジを取り出します。 3 試薬カートリッジに 印刷されている水位線までの、試薬カートリッジの底がつかるのに 十 分なだけの室温の脱イオン水が入っている水槽に、試薬カートリッジを置きます。 水が 最 高水位線 (Maximum Water Line) を超えないようにしてください。 4 約 1 時間、または内容物が完全に解凍される まで、室温の水槽内で 試薬カートリッジを 解凍させます。 5 試薬カートリッジを水槽か ら取り出し、ベンチの上で軽くたたいて、カートリッジの底に 付 いている水を落とします。 カートリッジの底から水分を拭き取ってください。 試薬カートリッ ジの上部から水が飛び散っていないことを確認します。 Inspect the Reagent Cartridge (試 薬 カート リッジの確 認 ) 1 試薬カートリッジを 10 回転倒混和し、解凍された試薬を混ぜ合わせ、すべての位置で 解 凍されていることを目視で確認します。 2 試薬カートリッジの位置 1 の試薬を目視で確認し、完全に混和されており、沈殿物がない ことを確認します。 3 ベンチの上でカートリッジを軽くたたき、試薬内の気泡を減らします。 注意 MiSeq シッパーチューブは、各リザーバーの底部から試薬を吸引します。そのため、リ ザーバーに気泡がないようにすることが重要になります。 12 パーツ番 号 15034097_JPN 改 訂 B ランをセットアップ する準備が できるまで、試薬カートリッジは氷の上に置いておくか、ま たは 2° ～ 8 °C で 保管しておきます。 最良の結果を得るためには、サンプルをロード してランをセットアップする手順へと直ぐに進んでください。 警告 この試薬のセットには、生殖毒性の可能性が高い脂肪族アミドである、ホ ルムアミド が 含まれています。 吸入、経口摂取、皮膚や目への接触により、怪我をする可能性があ ります。 廃液や未使用の内容物は、地域の行政安全基準に従って廃棄してください。 詳細については、http://www.illumina.com/msds でこのキットの MSDS (化学物質安 全データシート) を参照してください。 MiSeq 試 薬 調 製 ガイド 13 Preparing Reagents (試 薬 の準 備 ) 4 What's Next (次 の手 順 ) 試薬カートリッジを適切に 解凍後、 MiSeq システム ユーザーガイド 、パーツ番号 15027617_ JPNに記述されている以下の手順に進みます。 1 クラスター形成およびシーケン ス用に、ライブラリーの変性および希釈を行ってくだ さい (TruSeq アンプリコンライブラリーをシーケンスする場合を除く) 。 2 試薬カートリッジの「Load Samples」とラベルされたリザーバーにライブラリーをロードしてく ださい。 3 MiSeq Control Software (MCS) インターフェースに 表示されるランのセットアップ 手順に 従ってフローセルおよび試薬をロードし、その後ランを開始します。 マニュアル、ソフトウェアダウンロード、および FAQ にアクセスするに は、Illumina Web サイト の MiSeq サポートページを開いてください。MiSeq トレーニングコースの包括的な一覧を表示 するには、www.illumina.com/training/miseq を開いてください。 14 パーツ番 号 15034097_JPN 改 訂 B 注意 テクニカルサポートに関しては、Illumina テクニカルサポートまでお問い合わせください。 表 2 Illumina 一般問合わせ先情報 Illumina Web サイト 電子メール http://www.illumina.com techsupport@illumina.com 表 3 Illumina カスタマーサポート電話番号 地域 問合わせ先番号 地域 問合わせ先番号 北米 1.800.809.4566 イタリア 800.874909 オーストリア 0800.296575 オランダ 0800.0223859 ベルギー 0800.81102 ノルウェー 800.16836 デンマーク 80882346 スペイン 900.812168 フィンランド 0800.918363 スウェーデン 020790181 フランス 0800.911850 スイス 0800.563118 ドイツ 0800.180.8994 イギリス 0800.917.0041 アイルランド 1.800.812949 その他の国 +44.1799.534000 MSDSs (化学物質安全データシート) 化学物質安全データシート( MSDS) は Illumina の Web サイト http://www.illumina.com/msds でご覧になれます。 製品マニュアル 追加の製品マニュアルが必要な場合は、Illumina の Web サイトから PDF ファイルでご利用い ただけます。http://www.illumina.com/support に移動して製品を選択してください。マニュア ルをダウンロードする には、MyIllumina にログインするよう要求されます。ログイン後、PDF を 表示または保存できます。MyIllumina アカウントに登録するに は、https://my.illumina.com/Account/Register を開いてください。 MiSeq 試 薬 調 製 ガイド Technical Assistance (テクニカルサポート ) Technical Assistance (テクニカルサポート ) Illumina Headquartered in San Diego, California, U.S.A. +1.800.809.ILMN (4566) +1.858.202.4566 (outside North America) techsupport@illumina.com www.illumina.com
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