B D FA C S TM Review Vo l . 4 ES細胞からの血管内皮細胞への分化誘導におけるFACSを利用した高速ソーティング日本ベクトン・ディッキンソン株式会社神戸ラボラトリー廣瀬弥保熊本大学発生医学研究センター教授小川峰太郎 Key words: マウスES細胞、Flk-1+/E-Cadherin- 中胚葉細胞、高速ソーティング 1. はじめにるマーカー次第でいくらでも細かくすることができる。また、培養の規模を大きくすれば細胞の数を十分に増やすこともできる。このように、「技術の上に科学の層がゆっくりと沈殿してゆく」とフェルナン・ブロー ES細胞の試験管内分化系を利用すれば、実際の個体から分離することデルは表現したが、技術と科学の進歩は現代において確実にその歩をが困難な分化中間段階にある細胞を必要な数だけ純化して、その分化早めており、フローサイトメトリーもその例外ではない。フローサイトメ能力を追跡したり遺伝子発現プロファイリングを行ったりすることが可トリーという技術の上には当初免疫学・血液学の成果が堆積したが、現能になる。在では医学のみならず農学や海洋生物学にあってもフローサイトメトリーは重要な技術として役立っている。基礎生物学の中でも、近年の幹 ES細胞から分化誘導した分化中間段階の細胞を十分な数だけ分離する細胞生物学の興隆と相まって、発生学の研究フィールドにおいてフロー場合、FACSVantageSE/DivaやFACSAriaが備える高速ソーティング機サイトメトリーの恩恵が広まりつつある。胚性幹細胞（ES細胞）の試験管能は頼もしい味方となる。しかし、培養からほぐしてきた細胞が高速内分化実験系とフローサイトメトリーの応用はその一例であろう。ソーティングに耐えるかどうかなど留意すべき点もいくつかある。ここでは、ES細胞から血管内皮細胞への分化誘導を行う実験において、分 ES細胞を試験管内で分化させる実験系は、特定の細胞系列の発生過程化中間段階として中胚葉細胞をフローサイトメトリーで分離する際の条をいくつかの段階に分けて、その各段階における分化のメカニズムを件について、特に高速ソーティングにおけるシース圧の影響に重点を解析することができる優れたツールである。各分化段階に分ける時に置いて検討を行った。検討された項目は、高速ソーティング中の蛍光欠かすことのできない技術がフローサイトメトリーである。例えば、ES 強度、分取された細胞の純度、回収率、ソーティング後の生存率、分化細胞をある条件下で培養すると中胚葉細胞へ分化するものが現れる。効率等であり、実際に実験を行うにあたって必ず問題となるパラメーこの中胚葉細胞をフローサイトメトリーで分離してさらに培養すると血ターを網羅している。高速ソーティングを利用した細胞分化研究を計管内皮細胞や心筋細胞等が分化する。このようなステップは利用でき画しているユーザーにとってこれらが有用な情報となれば幸いである。 2. 準備 • 細胞染色用buffer （HBSS/BSA）（HBSS, Invitrogen社, 14185-052） Hanks' Balanced Salt Solution 1. 細胞に1%ウシ血清アルブミン（BSA, Sigma社, A1253）を加え、ろ過滅菌したものを用いる。 1 本実験には、CCE株を用いた。 2. 分化誘導のために必要な試薬 • • 3. 分化誘導のために必要な器具・装置分化誘導培地 Minimum Essential Medium α Medium（Invitrogen社, 11900016） 10% Fetal Bovine Serum（FCS）（Sigma社, M7522） 5×10-5M 2-mercaptoethanol（2ME） • Cell dissociation buffer（Invitrogen社, 13150-016） • Dulbecco's Phosphate Buffered Saline（Invitrogen社, 14190144） • BioCoat Collagen IV coated 100 mm dish（BD Biosciences, 354453） • BioCoat Collagen IV coated 35 mm dish（ BD Biosciences, 354459） • モノクローナル抗体 Alexa Fluor® 488-anti-mouse E-cadherin（clone; ECCD2） FACSFlow（BD Biosciences, 342003） • 50 mLコニカルチューブ（BD Biosciences, 352070, 352073） • 15 mLコニカルチューブ（BD Biosciences, 352196, 352095） • 40 µm セルストレーナー（BD Biosciences, 352340） • 5 mLポリスチレンチューブ（BD Biosciences, 352058） • 5 mLポリスチレンチューブセルストレーナー付（BD Biosciences, 352235） • 遠心機 • インキュベーター • FACSAria（BD Biosciences） • FACSVantageSE Diva option（BD Biosciences） • FACSCanto（BD Biosciences） • その他ピペット類 PE-anti-mouse Flk-1（ clone; Avas12 α 1, BD Biosciences, 555308） FITC- anti-mouse CD31（clone; MEC 13.3, BD Biosciences, 553372） Biotin- anti-mouse VE-cadherin（clone; VECD1） Streptavidin-APC（BD Biosciences, 554067）（clone; Purified anti-mouse CD16/CD32（Mouse BD Fc Block） 2.4G2, BD Biosciences, 553141） • 7-Amino-Actinomycin D（BD Biosciences, 559925） Fig. 1 ES細胞から血管内皮細胞への分化経路未分化なES細胞を、フィーダー細胞やコラーゲンIVのプレート上で培養することにより、Flk-1陽性中胚葉細胞へと分化誘導します。Flk-1陽性中胚葉細胞を分取し、さらに培養することにより、血管内皮細胞および血液細胞へと分化します。 2 www.bdbiosciences.com 3. 方法 3. 血管内皮細胞への分化誘導 ─ 分化誘導方法に関して ─ ① プロトコール2-③で分取したFlk-1+/E-cadherin-中胚葉細胞を分化誘導用培地に懸濁し、BioCoat Collagen IV coated 35 • 本実験には、マウスES細胞（CCE株）を用いて未分化なES細胞から中胚葉細胞、血管内皮細胞へ分化させた。その際、フィーダー細胞 mm dish当たり4.5×105 cellsの濃度で播く。分化誘導培地は、 35 mm dish当たり3 mL加える。を使用せず、コラーゲン IV をコートした dish を用いて分化誘導さ 2 せた（Fig. 1）。 1. ES細胞から中胚葉細胞への分化誘導 ② 37°C、5%CO2で2.5日間培養する。 ③ 培養上清を回収し、DishをPBS（-）で1回洗浄する。次に, Cell Dissociation Bufferを添加し、37°C, 5% CO2で10分間静置 ① 通常のトリプシン処理により未分化 ES 細胞を回収し洗浄した後、分化誘導培地に懸濁する。BioCoat Collagen IV coated 100 mm dish当たり1.2×105 cellsの濃度で播く。分化誘導培地は、100 mm dish当たり18 mL加える。 ② 37°C、5%CO2で4日間培養する（ESC4）。 2. 中胚葉細胞の純化する。プレートを軽くたたいて一部の細胞が浮くようになったら、ピペッティングにより細胞をプレートから剥がし、上清を回収した試験管に回収する。凝集した細胞が多い場合は、40 µm セルストレーナーに通して、300×G, 4°C, 5分間遠心し、上清を除く。 ④ HBSS/BSA で細胞を懸濁し、細胞を計数する。再度、遠心（300×G, 4°C, 5分）した後、表面抗原の染色を行なう。 ① 培養上清を回収し、DishをPBS（-）で1回洗浄する。次に, Cell Dissociation Bufferを添加し、37°C, 5% CO2で10分間静置する。プレートを軽くたたいて一部の細胞が浮くようになったら、ピペッティングにより細胞をプレートから剥がし、試験管に回収する。凝集した細胞が多い場合は、40 µm セルストレーナーに通して、300×G, 4°C, 5分間遠心し、上清を除く。 ② HBSS/BSAで細胞を懸濁し、細胞を計数する。再度遠心（300× a）106 cellsに対して 0.25 µgのPurified anti-mouse CD16/ CD32を添加し、5分間 4°Cに静置する。 b）FITC- anti-mouse CD31 、Biotin- anti-mouse VEcadherin を適量添加する。4°C, 暗所で 30 分間インキュベートする。（300×G, 4°C, 5分）。 c）HBSS/BSAで洗浄するした後、表面抗原の染色を行なう。 G, 4°C, 5分） a）10 6 cells に対して 0.25 µg の Purified anti-mouse d）Streptavidin-APCを適量添加する。4°C, 暗所で30分間インキュベートする。 CD16/CD32を添加し、5分間 4°Cに静置する。 b）Alexa Flour ® 488-anti-mouse E-cadherin 、PE-antimouse Flk-1 を適量添加する。4°C, 暗所で 30 分間インキュベートする。（300×G, 4°C, 5分）。 c）HBSS/BSAで洗浄する（300×G, 4°C, 5分）。 e）HBSS/BSAで洗浄する f）測定直前にセルストレーナー付5 mLポリスチレンチューブに通し7AADを添加する。 ⑤ FACSCantoにより解析し、CD31+/VE-cadherin+画分を血管内皮細胞とする（Fig. 3）。 d）測定直前にセルストレーナー付5 mLポリスチレンチューブに通し7AADを添加する。 ③ FACSAriaにより解析し、Flk-1+/E-cadherin-画分を分取する（Fig. 2）。 Fig. 2 ES細胞CCE株から中胚葉細胞への分化誘導方法 Fig. 3 Flk-1陽性中胚葉細胞から血管内皮細胞への分化誘導方法 www.bdbiosciences.com 3 2. 高速ソーティング（シース圧の違いよる）による分化能への影響 −検証項目とその方法− • FACSを用いた ES純化における高速ソーティングによる細胞機能への影響を検討した。 ① ESC4を回収したのち、Flk-1/E-cadherinで染色。 ② FACSAria および FACSVantageSE/Diva を用いて Flk-1+/E- ことにより、最大3万個/秒程 FACSでは細胞を高速で流す（20∼70 psi） cadherin-分画を各シース圧でソーティング。 3 度の速度で細胞を分取する技術を報告している。今回はES細胞から血管内皮細胞への分化誘導におけるFACSによる高速ソーティングによる細胞機能への影響を紹介する。 FACSを用いた細胞解析に関する検証内容測定にはFACSAria、FACSVantagSE with DiVaを用いて細胞を流す圧力を10, 20, 35, 70 psiにて分取を行い下記の3項目に関して検証実験を行なった。 5 ④ コラーゲンIVのプレート上に4×10 cells播種し、2.5日間培養。 ⑤ 2.5日後にcell Dissociation Bufferで回収し、洗浄。 ⑥ トリパンブルーで計数。 ⑦ CD31 FITC/VE-cadherin APCで染色し、FACS解析。 3. 高速ソーティング（シース圧の違いよる）による回収率・蛍光検出感 1. 高速ソーティング（シース圧の違いよる）による生存率・細胞増殖能への影響度への影響 ① ESC4 （コラーゲンIVで4日間培養したES細胞）を回収したのち、 ① ESC4を回収した後、Flk-1/E-cadherinで染色。 ② FACSAriaおよびvantageSE/Divaを用い、Flk-1+/E-cadherin- Flk-1/E-cadherinで染色。 ② FACSAria を用い、Flk-1+/E-cadherin- 分画を各 speed で TruCOUNT Tubeに直接ソーティング。分画を各シース圧で分取。 ③ ソーティング後すぐにMediumで洗浄し、トリパンブルーを使用し血球計算板で計数。 ③ 洗浄。 ③ 試験管内を洗い込み、7-AADを添加した後、FACSCaliburで計数。 Fig. 4 FACSを用いた細胞解析に関する検証内容および検証したシース圧 4 www.bdbiosciences.com 4. 結果高速ソーティング（シース圧の違いよる）による生存率・細胞増殖能への影響各シース圧によるsorting mode は Fig. 5に示す。70 psi の高速ソーティングにおいて 85% ∼ 95%の細胞生存率であることが確認された。通常のシース圧である10 psi to 20 psiでは99 %∼97%と比較して生存率が10%程度低下する傾向はあるが、ES分化誘導を目的とした実験では高速ソーティング85%∼95%の細胞生存率は許容範囲内であると考える（Fig. 5）。シース圧による細胞増殖能への影響分取後の細胞をコラーゲンIVプレート上にて培養して細胞増殖能への影響を検証した。各シース圧ともに増殖しており顕著な違いは確認できなかった（Fig. 6）。高速ソーティング（シース圧の違いよる）による分化能への影響 FACSAria、FACSVantage SEを用いて各シース圧にて分取したES細胞の血管内皮細胞分化率をVE-cadherin+/CD31+の発現率をFACSCaliburにて解析して、シース圧による分化能への影響を検証した。 Fig. 5 シース圧による細胞生存率への影響分化誘導率は8%∼11%でありシース圧による分化能への影響は確認されず、むしろ高速ソー（上）FACSVantage SE Divaoptionを用いて分取した結果。（下）FACSAriaを用いて分取した結果。ティング（70 psi）での分化率は通常のシース圧比べて高いことが確認された（Fig. 7）。 Fig. 7 ソーティング時のシース圧の変動による血管内皮細胞分化率への影響（n：4）（上）FACSVantage SE Divaoptionを用いて分取した結果。（下）FACSAriaを用いて分取した結果。 Fig. 6 ソーティング時のシース圧による増殖への影響各シース圧で分取したFlk-1+/E-cadherin-/7AAD-分画の細胞を、コラーゲンIV プレート上で培養した2.5日目の顕微鏡写真 www.bdbiosciences.com 5 高速ソーティング（シース圧の違いよる）による回収率・蛍光検出感度への影響 FCMの原理的特性として、シース圧を高めてソーティングを行う場合に蛍光検出するレーザーを細胞が通過する速度が高まり、結果としてレーザーに照射される時間が短くなる。よって蛍光検出シグナルが低下することが考えられた。しかし、パルス処理方法をデジタル波形処理してスケーリングファクターを設定することにより蛍光シグナルの低下を補うことが出来た（Fig. 8、9）。また、VantageSE/DivaとAriaでは、同じサンプルにもかかわらず、陽性率に差がみられた。これは、Divaは、jet-in-air方式であるのに対して Fig. 8 FACSVantageSE/Divaによる高速ソーティングによる蛍光感度への影響 Ariaは、フローセルを使用することにより、蛍光検出感度が良くなったためと考えられる（Fig. 8、9）。純度・収率細胞解析数が3万個/secを越えるとソーティング純度が低下する傾向が確認された。細胞解析数が3万個/secを越えるとソーティング収率は100%を越えることが確認された（Fig. 10）。主な原因としては70 µノズルにて液滴形成数9万液滴/secを形成した場合に ES細胞が液滴1滴中にしめる割りあいが大きく、細胞が液滴の両端に位置した場合はセンターストリームが広がる傾向がある。この現象によりアボートされたはずの細胞が試験管内に混入したことが考 Fig. 9 FACSAriaによる高速ソーティングによる蛍光感度への影響えられる。改善点としては液滴のサイズを大きくする為にノズル径を 100 µに変更および液滴形成数を減少させることが考えられる。しかし、高速ソーティングの収率を考えた場合にはソーティングアボートが上昇し結果として収率が低下するので適切でない為この条件は推奨しない。 Fig. 10 高速ソーティングによる純度・収率への影響それぞれの機種において70 psiで1秒間に測定する細胞数を変化させ時の、収率の変動。（左）FACSVantage SE Divaoptionを用いて分取した結果。（右）FACSAriaを用いて分取した結果。 6 www.bdbiosciences.com 5. 結論 ES細胞のソーティングでは解析速度は2万個以下に設定して、ノズル 70 µ、シース圧70 psiで分取することが効率の良い条件と考える。生存率および分化能については、シース圧における細胞への影響は少なく、高速ソーティングをもちいた細胞分離による顕著な影響は確認されなかった。よって従来の細胞分離と比較して分離時間が短縮できることから有用な手段となると思われる。トラブルシューティング実験の注意点トラブル原因と解決方法コラーゲンIVプレート上で細胞が増えない • 播く細胞数が適切でない可能性が考えられるので播く細胞数を検討する培養中にコンタミをおこす • medium等がすでに汚染されていないか確認する • Sortブロックの周辺を70%アルコールで滅菌するシース圧を上げると蛍光感度が低下する • Laser delay timeを正確に設定する • Area Scaling Factorを正確に設定するソーティング後再解析を行うと純度が悪い • Thresholdの設定が適切にされていない。Threshold以下の細胞は、SortされるDropの中に混ざっていたとしてもSortされるので解析時に、Sortしたくない分画もplot上に表示されるようにする • 凝集した細胞をSortしていると考えられるので、dabletの除去を行う回収率が悪い • 回収用のチューブの壁について死んでしまっている可能性があるので、回収用のチューブにできるだけたくさんmediumを添加しておく機器操作の注意点データ−解析の注意点：スケーリングファクター調整、Gate方法など＜参考文献＞ PROFILE 1） Robertson E, Bradely A, Kuehn M, Evans M: Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature 323:445, 1986 2） Ogawa M, Kizumoto M, Nishikawa S, Fujimoto T, Kodama H, Nishikawa SI: Expression of α4-integrin defines the earliest precursor of hematopoietic cell linage diverged from endotherial cells. Blood 98:1168, 1999 3）廣瀬弥保ほか：第32回日本免疫学会学術集会講演要旨（2002）氏名：小川峰太郎博士（薬学）所属：熊本大学発生医学研究センター経歴：昭和59年3月金沢大学薬学部製薬化学科卒業平成4年3月博士（薬学）取得（金沢大学大学院薬学研究科）平成4年4月熊本大学医学部附属遺伝発生医学研究施設助手平成5年11月京都大学医学部助手平成7年10月バーゼル免疫学研究所（スイス連邦バーゼル）研究員平成12年11月京都大学大学院医学研究科助教授平成14年5月熊本大学発生医学研究センター教授現在に至る研究テーマ：胚性幹細胞から血液細胞・血管内皮細胞・心筋細胞への分化メカニズムの解明 www.bdbiosciences.com 7 * BD、BDロゴおよびその他のすべての商標はBecton Dickinson and Companyのプロパティです。©2006 BD 日本ベクトン・ディッキンソン株式会社 BD Biosciencesに関する技術的、学術的なお問い合わせ先〒107-0052 東京都港区赤坂4-15-1 赤坂ガーデンシティアプリケーションホットライン Tel: 03-5805-9960 技術研修室 E-Mail: tech_cell@bd.com 機器修理・メンテナンス www.bd.com/jp/ お客様情報センター製品関連・資料請求／納期・在庫 0120-8555-90 Fax: 024-593-5761 試薬カスタマーサポート 0120-7099-12 0120-4890-77 E-Mail: tech_cell@bd.com 64-117-00 R0-0608-000.5-556