Intercellular localization of occludins and ZO

●第 45 回日本人工臓器学会大会 論文賞(代謝領域)受賞レポート
Intercellular localization of occludins and ZO-1 as a solute
transport barrier of the mesothelial monolayer
* 1 三重大学大学院工学研究科分子素材工学専攻,* 2 同 医学部附属病院血液浄化療法部
金田 健一* 1,宮本 啓一* 1,の村 信介* 2,堀内 孝* 1
Ken-ichi KANEDA, Kei-ichi MIYAMOTO, Shinsuke NOMURA, Takashi HORIUCHI
1. 目 的
長期腹膜透析に合併する腹膜機能劣化は溶質透過性の亢
進としてとらえられる場合が多いが,多層構造である腹膜
各層の構造変化やそれに伴う機能劣化を in vivo の情報か
ら言及することは極めて困難である。本研究では,溶質透
過には細胞間結合装置の一つである tight junction1) に重要
(
(
)
4V
Ca0 − 4Cb4
(m/s)
K =−
ln
Δ t・A
Ca0 − 4Cb2
)
V: basal 側体積(m3),A: 膜面積(m2), Δ t: 時間変化(s)
,
,
Ca0 : apical 側初期濃度(μg/ml)
,
Cb2 : 2 時間後の basal 側濃度(μg/ml)
Cb4 : 4 時間後の basal 側濃度(μg/ml)
な役割があると考え,腹膜中皮細胞(human peritoneal
測定は 37℃で行い,蛍光測定装置(F-2000, HITACHI,
mesothelial cell, HPMC)を膜支持体上に培養した腹膜透過
Tokyo, Japan)を用いた。また,1 mM,0.1 mM の過酸化水
モデルを作成し,その透過特性と細胞間結合分子との関係
素を含む培地で 30 分インキュベートし,過酸化水素の溶質
を調べることを目的とした。
透過性へ与える影響を調べた。
3)免疫染色
2. 方 法
細胞間結合蛋白オクルディン,ZO-1 を免疫染色し共焦点
1)膜間電気抵抗測定
レーザー顕微鏡(FV1000, Olympus, Tokyo, Japan)を用い
ヒト大網から単離,培養した HPMC を孔径 0.4 μm ポリ
てその分布を観察した。一次抗体には rabbit anti-ZO-1
エ ス テ ル 膜(Transwell, Costar, MA, USA)上 に 5 × 10 4
antibody と rabbit anti-occludin antibody(Zymed Laboratries
cells/cm2 の密度で播種し,10% FCS/M199 で培養した。
Inc., CA, USA)を用い,二次抗体には polyclonal swine anti-
細胞間の結合状態は 2 本の電極対で構成されている STX-2
rabbit immunogloblins labeled with FITC(Dako, Glostrup,
電 極 と EVOMボ ル ト オ ー ム メ ー タ ー(World Precision
Denmark)を使用した。また,0.1 mM の過酸化水素を含む
Instruments)を用いて測定した。電圧検知用± 20 μA の交
培地で 30 分インキュベートし,過酸化水素の細胞間結合蛋
流矩形波電流を 12.5 Hz の低周波で印加し,両端の電圧測
白の局在化へ与える影響を調べた。
定から,オームの法則 R = V / I より抵抗値を算出した。膜
間抵抗値が一定となった時点を,confluent とした。
2)溶質透過性試験
3. 結 果
図 1a に HPMC 播種後の膜間電気抵抗の変化を示す。本
confluent 後の HPMC 単層を腹膜透過モデルとして,蛍光
実験条件下では,ほぼ 3 日でプラトーに達した。この細胞
ラベルした分子量 4,10,70,150 kDa のデキストランの溶
間結合状態は 0.1 mM の過酸化水素曝露により,30 分以降
質透過係数 K を以下の式より求めた。
に有意な減少が示された(図 1b)
。
図 2 に溶質透過性の結果を示した。ポリエステル膜のみ
■著者連絡先
三重大学工学部分子素材工学科生体材料化学研究室
(〒 514-8507 三重県津市栗真町屋町 1577)
E-mail. horiuchi@chem.mie-u.ac.jp
(blank)に比べると,HPMC 単層(control)では溶質透過性
が低下し,物質移動の抵抗として働いていることが認めら
れた。その透過性には分子量依存性が見られ,過酸化水素
人工臓器 37 巻 1 号 2008 年
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(a)
(b)
図 1 Changes in TER
(a)Development of TER in the HPMC monolayer cultured on a polyester membrane support.
(b)Change in TER of the HPMC monolayer due to exposure to 0.1 mM H2 O2 .
TER, transepithelial electrical resistance; HPMC, human peritoneal mesothelial cell.
図 2 Solute permeability coefficient of polyester membrane for
each molecular marker with and without the HPMC
monolayer
HPMC, human peritoneal mesothelial cell.
添加により溶質透過性は亢進した。また,特に 4 kDa デキ
ストランにおいて,過酸化水素による透過性亢進に濃度依
図 3 E f f e c t o f 0.1 m M H 2 O 2 e x p o s u r e o n i n t e r c e l l u l a r
localization of occludins and ZO-1
存性が見られた。
図 3 に免疫染色による蛍光画像を示す。細胞間隙部位に
オクルディン,ZO-1 が局在していることが確認できた。ま
た,過酸化水素添加によりオクルディンの間隙部での局在
化の著しい低下が見られ,ZO-1 においても一部局在化の低
5. 独創性
腹膜は多層の複合膜であり,その透過性の亢進を個々に
把握するためには単層培養系を用いる以外手段は無い。特
下が見られた。
に,HPMC 単層の溶質透過性を取り扱った先行研究は無い
4. 結 論
が可能となる本実験法は,腹膜透析における溶質透過性亢
ため,同一実験条件下で血管内皮細胞単層との透過性比較
以上の結果より,過酸化水素が HPMC 単層の溶質透過性
亢進の一因になることが認められた。また,透過性亢進は,
結合タンパクの構造変化などにより分子間の結合が弱ま
り,間隙部の非局在化が起こることが原因であると考えら
れる。
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進のメカニズムを解明するための強力なツールとなり得る。
文 献
1) Harhaj NS, Antonetti DA: Regulation of tight junctions and
loss of barrier function in pathophysiology. Int J Biochem
Biol 36: 1206-37, 2004
人工臓器 37 巻 1 号 2008 年