Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β’, Τόμος 15, Τεύχος 3, σελ. 126-141 2010 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΕΙΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΙΟΓΕΝΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΑΝΤΟΧΗΣ Ε. ΚΡΑΝΙΩΤΑΚΗ1, ΕΥΑΓΓ. ΠΛΑΤΣΟΥΚΑ2 Η ανακάλυψη των αντι-ιικών φαρμάκων για τη θεραπεία λοιμώξεων, υπήρξε ένα από τα σημαντικά ιατρικά επιτεύγματα του περασμένου αιώνα. Η αποτελεσματική αντι-ιική χημειοθεραπεία είναι η μόνη ελπίδα για την επιβίωση ή την ανακούφιση εκατομμυρίων ανθρώπων παγκοσμίως που πάσχουν από κάποια χρόνια ιογενή λοίμωξη, συμπεριλαμβανομένων αυτών που προκαλούνται από τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας, τους ιούς της ηπατίτιδας Β και C. Όμως παρά τη σημαντική πρόοδο στην ανάπτυξη αποτελεσματικών αναστολέων που στοχεύουν σε συγκεκριμένα στάδια του κύκλου ζωής των ιών, η θεραπευτική δραστικότητα έχει περιοριστεί από την εμφάνιση ανθεκτικών ιών. Τα ανθεκτικά στελέχη έχουν μεγάλη κλινική σημασία κυρίως για τους ανοσοκατασταλμένους ασθενείς, όμως εμφάνιση και μετάδοση των μεταλλαγμένων ανθεκτικών ιών έχει παρατηρηθεί και στον ανοσοεπαρκή πληθυσμό. Νέες προσεγγίσεις για την ανάπτυξη διαγνωστικών και θεραπευτικών μεθόδων ή στρατηγικών πρόληψης, είναι απαραίτητες για να ενισχύσουν το βασικό πεδίο έρευνας. (Λέξεις ευρετηρίου: αντοχή στα αντι-ιικά, ιοί ηπατίτιδος και γρίπης, HIV, CMV, γονοτυπικές και φαινοτυπικές δοκιμασίες). Αντι-ιική χημειοθεραπεία Η σύντομη ιστορία της αντι-ιικής χημειοθεραπείας ως επιστήμης αρχίζει τη δεκαετία του 1950 με την ανακάλυψη της μεθισαζόνης, μιας θειοσεκαμικαρβαζόνης που αναστέλλει την αναπαραγωγή των ιών της ευλογιάς. Σήμερα, ισχυρά φάρμακα είναι διαθέσιμα έναντι ιών του έρπητα, του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρ1. Μικροβιολογικό Τμήμα, Γ.Ν.Α. «Ο Ευαγγελισμός». 2. Μικροβιολογικό Τμήμα, «Κωνσταντοπούλειο» Γ.Ν. Ν. Ιωνίας κειας (HIV), του ιού της ηπατίτιδας Β (ΗΒV) και του ιού της γρίπης. Καινούργια φάρμακα αναμένονται κατά τη διάρκεια των επόμενων 5-10 ετών, για την αντιμετώπιση των ιών των ανθρώπινων θηλωμάτων (papillomaviruses), των αναπνευστικών ιών, των εντεροϊών και του ιού ηπατίτιδας C (HCV). Στην Ελλάδα αυτή την περίοδο κυκλοφορούν 42 εγκεκριμένα από τον Ε.Ο.Φ. αντι-ιικά φάρμακα (εκτός των ιντερφερονών). Οι στόχοι των αντι-ιικών φαρμάκων για τον επακόλουθο σχεδιασμό τους, αφορούν στα διάφορα στάδια του βιολογικού Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 κύκλου ζωής του ιού (προσκόλληση, διείσδυση, έκδυση, σύνθεση μακρομορίων, ωρίμαση, απελευθέρωση). Η αντι-ιική χημειοθεραπεία έχει οδηγήσει σε τεράστιες βελτιώσεις στη διαχείριση ορισμένων ιικών λοιμώξεων. Τα αντι-ικά φάρμακα έχουν βελτιώσει σημαντικά την πρόγνωση και έχουν αυξήσει το μέσο όρο ζωής σε πολλούς ασθενείς με τη νόσο του HIV. Επίσης, έχουν συμβάλει στην επιτυχή αντιμετώπιση ασθενών με χρόνια ηπατίτιδα Β ή με ηπατίτιδα C και ανοσοκατασταλμένων ασθενών με κίνδυνο λοίμωξης από τον ανθρώπινο κυτταρομεγαλοϊό (ΗCMV). Ακόμα και στις περιπτώσεις ιών που παραμένουν σε λανθάνουσα κατάσταση (ερπητοϊοί) ή ιών που αναπτύσσουν χρόνιες λοιμώξεις (HIV και ΗΒV), αν και ο ιός δεν εκριζώνεται από τον οργανισμό με τη θεραπεία, όμως καταστέλλεται αποτελεσματικά η αναπαραγωγή του. Ωστόσο, η αντι-ιική χημειοθεραπεία παρουσιάζει προβλήματα. Εκτός από την τοξικότητα των φαρμάκων, τις ανεπιθύμητες ενέργειες και το υψηλό κόστος, η εμφάνιση αντοχής στα αντι-ιικά αποτελεί το μεγαλύτερο εμπόδιο για την επίτευξη των θεραπευτικών στόχων. Αντοχή έχει τεκμηριωθεί έναντι όλων σχεδόν των αντι-ιικών φαρμάκων και η γενετική βάση της αντοχής είναι πλέον γνωστή. Βιολογική βάση της αντοχής στα αντι-ιικά φάρμακα Η αντοχή στα φάρμακα ορίζεται ως η μειωμένη ευαισθησία σε ένα φάρμακο σε ένα σύστημα εργαστηριακής καλλιέργειας και εκφράζεται με την αλλαγή της IC50 ή IC90 (συγκέντρωση φαρμάκου που απαιτείται για να εμποδίσει την αναπαραγωγή του ιού κατά 50% ή 90% αντίστοιχα). Αυτό καλείται φαινοτυπική αντοχή. Η φαινοτυπική αντοχή καθορίζεται από συγκεκριμένες μεταλλάξεις στο γονιδίωμα του ιού (γονοτυπική αντοχή), οι οποίες οδηγούν σε αλλαγές στην ιική πρωτεΐνη-στόχο (όπως η ανάστροφη μεταγραφάση του HIV) ή στον ιικό 127 ενεργοποιητή φαρμάκων (όπως η θυμιδινική κινάση του έρπητα τύπου Ι). Τέλος, υπάρχει και η διασταυρούμενη αντοχή, που ορίζεται ως η αντοχή του ιού σε έναν αριθμό φαρμάκων της ιδίας ομάδας, που επηρεάζονται παρομοίως από τον ίδιο μηχανισμό αντοχής1. Πολύ συχνές μεταλλάξεις παρατηρούνται στους κλασικούς ιούς RNA, όπως ο HIV και ο ιός της γρίπης. Αυτό είναι επακόλουθο της έμφυτης, μη υψηλής πιστότητας ανάγνωσης των ιικών RNA πολυμερασών, οι οποίες είναι υπεύθυνες για τον πολλαπλασιασμό του ιικού γονιδιώματος, οδηγώντας έτσι σε σφάλματα κατά τη μεταγραφή, λόγω έλλειψης ενζυμικών μηχανισμών που διορθώνουν τα λάθη μεταγραφής από RNA σε DNA ή RNA σε RNA2. Ακολούθως, προκύπτει ένα ευρύ φάσμα γενετικών παραλλαγών του ιού (quasispecies), συμπεριλαμβανομένων εκείνων με μεταλλάξεις που σχετίζονται με την αντοχή στα αντι-ιικά φάρμακα. Η χρήση ενός αντι-ιικού φαρμάκου παρέχει την πίεση για την προνομιακή αναπαραγωγή των γενετικών παραλλαγών του ιού με μειωμένη ευαισθησία στα φάρμακα σύμφωνα με τις αρχές της εξέλιξης του Δαρβίνου. Ο ανθεκτικός στα φάρμακα ιός που προκύπτει, θα έχει καλύτερη ικανότητα αναπαραγωγής (viral fitness) παρουσία του φαρμάκου. Μερικοί ανθεκτικοί στα φάρμακα ιοί, εντούτοις, δεν αναπαράγονται, όπως ο μη μεταλλαγμένος ιός (wild type virus), ελλείψει του φαρμάκου. Σε μερικές περιπτώσεις, πολλαπλές μεταλλάξεις απαιτούνται για την ανάπτυξη υψηλού επιπέδου αντοχής, και η ανεπαρκής καταστολή της αναπαραγωγής του ιού από τα αντι-ιικά φάρμακα είναι υπεύθυνη για τη διαδοχική απόκτησή τους3. Η συχνότητα μετάλλαξης στους ιούς DNA είναι κατά πολύ μικρότερη (μέχρι και 1000 φορές), οπότε το πρόβλημα της αντοχής στα φάρμακα είναι λιγότερο οξύ. Ωστόσο σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς, μεταλλάξεις σε DNA ιούς μπορεί να εμφανιστούν και να κυριαρχήσουν στον ιικό πληθυσμό (έρπης τύπου Ι ανθεκτικός στην ακυκλοβίρη, σε μεταμοσχευμένους ασθενείς)3. 128 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Τα κυριότερα προβλήματα που προκύπτουν από την αντοχή στα αντι-ιικά φάρμακα είναι τα εξής: – Αποτυχία της θεραπείας – Το μεταλλαγμένο (ανθεκτικό) στέλεχος ενδέχεται να είναι ακόμα παθογόνο – Οι εναλλακτικές θεραπείες μπορεί να είναι πολύ τοξικές ή να έχουν μεγάλο κόστος – Το μεταλλαγμένο (ανθεκτικό) στέλεχος μπορεί να μεταδοθεί σε άλλα άτομα. Κλινική σημασία της αντοχής Ερπητοϊοί Οι ερπητοϊοί (έρπης απλός, έρπης ζωστήρ, κυττταρομεγαλοϊός) είναι υπεύθυνοι για πολλές λοιμώξεις, οι οποίες έχουν συνήθως καλή έκβαση στους ανοσοεπαρκείς ασθενείς, ενώ σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς είναι απειλητικές για τη ζωή με υψηλή θνητότητα και νοσηρότητα. Ο απλός έρπης και ο έρπης ζωστήρ διαθέτουν το ένζυμο θυμιδινική κινάση (ΤΚ) το οποίο φωσφορυλιώνει τα νουκλεοτίδια που στη συνέχεια θα μετατραπούν σε τριφωσφορικά νουκλεοτίδια από κυτταρικά ένζυμα και με αυτή τη μορφή θα προστεθούν στην αυξανόμενη DNA αλυσίδα μέσω της ιικής DNA πολυμεράσης. Η ιική θυμιδινική κινάση έχει μικρότερη ειδικότητα ως προς το υπόστρωμα, σε σχέση με την κυτταρική θυμιδινική κινάση4. Ο κυτταρομεγαλοϊός δεν διαθέτει τη θυμιδινική κινάση, αλλά μια ομόλογη πρωτεΐνη, την UL97 η οποία δρα με παρόμοιο τρόπο5. Τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται σήμερα για τη θεραπεία λοιμώξεων από τους συγκεκριμένους ιούς, χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: α) στα νουκλεοσιδικά ανάλογα που έχουν ως στόχο την DNA πολυμεράση και απαιτούν φωσφορυλίωση από τις ιικές κινάσες, όπως είναι η ακυκλοβίρη και το προφάρμακό της βαλακυκλοβίρη, η πενσικλοβίρη και το προφάρμακό της φαμσικλοβίρη, η γκανσικλοβίρη και το προφάρμακό της βαλγκανσικλοβίρη και η βριβουδίνη β) στα φάρμακα που δεν απαιτούν φωσφορυλίωση από τις ιικές κινάσες και έχουν στόχο την DNA πολυμεράση, όπως είναι η βιδαραβίνη, η σιδοφοβίρη και η φοσκαρνέτη. Η ακυκλοβίρη (όπως και η πενσικλοβίρη) δρα μιμούμενη τα φυσικά υποστρώματα, κυκλοφορώντας στο εξωκυττάριο υγρό ως αδρανές μόριο και διαχεόμενη μέσα και έξω από το κύτταρο. Φωσφορυλιώνεται μόνο μέσα σε προσβεβλημένα από τον ιό κύτταρα, μέσω της θυμιδινικής κινάσης, έτσι ώστε η τυχόν φαρμακογενής τοξίκωση να αποφεύγεται ή να περιορίζεται στο μολυσμένο από τον ιό κύτταρο. Τα κυτταρικά ένζυμα μετατρέπουν στη συνέχεια το μονοφωσφορικό φάρμακο στην τριφωσφορική μορφή του, που είναι ισχυρός αναστολέας της ιικής DNA πολυμεράσης και σταματά την επιμήκυνση του ιικού DNA (Εικόνα 1). Αυτό συμβαίνει επειδή η ακυκλοβίρη δεν διαθέτει την 3~ υδροξυλιομάδα στον δακτύλιο του σακχάρου, απαραίτητη για τη σύνδεση με τη φωσφορική ρίζα και άρα την προσθήκη νέων βάσεων. Τέλος, η ακυκλοβίρη έχει μηδαμινή επίδραση στις κυτταρικές DNA πολυμεράσες6. Η γκανσικλοβίρη η οποία έχει δράση κυρίως κατά του κυτταρομεγαλοϊού, φωσφορυλιώνεται από την πρωτεΐνη UL977 στη μονοφωσφορική μορφή της και στη συνέχεια δρα στην τριφωσφορική μορφή της ως αναστολέας της DNA πολυμεράσης του ιού (Εικόνα 1). Η βριβουδίνη που χρησιμοποιείται με επιτυχία για τη θεραπεία του έρπητα ζωστήρα, έχει παρόμοιο μηχανισμό δράσης με τα προηγούμενα φάρμακα, μόνο που δεν σταματά την επιμήκυνση του ιικού DNA7. Η φοσκαρνέτη είναι ένα πυροφωσφορικό ανάλογο που δεν απαιτεί ενδοκυττάρια ενεργοποίηση, αλλά δρα απευθείας μπλοκάροντας το πυροφωσφορικό σημείο δέσμευσης της ιικής DNA πολυμεράσης, 7 εμποδίζοντας έτσι την ενσωμάτωση τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοσιδίων (dNTP’s) στο ιικό DNA (Εικόνα 1). Η σιδοφοβίρη είναι ένα νουκλεοσιδικό ανάλογο της κυτιδίνης, υπάρχει σε μονοφωσφορική μορφή και απαιτεί ενεργοποίηση (φω- Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 129 Εικόνα 1. Κύτταρο μολυσμένο από ερπητοϊό και μηχανισμός δράσης των αντι-ιικών φαρμάκων ακυκλοβίρης, γκανσικλοβίρης, σιδοφοβίρης και φοσκαρνέτης (τροποποίηση από βιβλιογραφική αναφορά 50). σφορυλίωση) από τα κυτταρικά ένζυμα για να δράσει έναντι του ιού7. Μόλις αποκτήσει τη διφωσφορική της μορφή, αναστέλλει την DNA πολυμεράση του ιού με μηχανισμό παρόμοιο με αυτόν της γκανσικλοβίρης (Εικόνα 1). Η βιδαραβίνη είναι ένα νουκλεοσιδικό πουρινικό ανάλογο το οποίο φωσφορυλιώνεται στην ενεργό του τριφωσφορική μορφή ara ATP, από τις κυτταρικές κινάσες και όχι τις ιικές. Το φάρμακο δρα αναστέλλοντας την DNA πολυμεράση και τερματίζοντας τη σύνθεση του ιικού DNA με μηχανισμό παρόμοιο με αυτόν της ακυκλοβίρης7. Οι ερπητοϊοί παρουσιάζουν χαμηλή συχνότητα μεταλλάξεων στο γονιδίωμά τους, επειδή η πολυμεράση τους έχει μηχανισμό που διορθώνει τα λάθη μεταγραφής από DNA σε DNA. Χρειάζονται επομένως πολλοί αναπαραγωγικοί κύκλοι για να προκύψει ένας ανθεκτικός ιός, ενώ παράλληλα η ικανότητα των φαρμάκων να αναστέλλουν την αναπαραγωγή των ιών, μειώνει ακόμα περισσότερο αυτή την πιθανότητα. Ωστόσο, έχει εμφανιστεί αντοχή σε όλα τα παραπάνω φάρμακα in vitro και in vivo3. O απλός έρπης (και πιο σπάνια ο έρπης ζωστήρ) αναπτύσσει αντοχή με τρεις βασικούς μηχανισμούς: α) Μετάλλαξη εξάλειψης, παρεμβολής ή σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο που κωδικοποιεί την ΤΚ. Το αποτέλεσμα είναι η παραγωγή μιας ελλειμματικής ΤΚ πρωτεΐνης, που είναι ενζυμικά ανενεργός. Αυτά τα στελέχη (ΤΚ minus), αναπαράγονται πολύ αργά εφόσον λείπει το γονίδιο λοιμικότητας ΤΚ, οπότε σε ανοσοεπαρκή άτομα αντιμετωπίζονται άμεσα από την ανοσιακή άμυνα του οργανισμού, αλλά είναι παθογόνα σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς (π.χ.HIV) προκαλώντας σοβαρές επιπλοκές8. β) Μετάλλαξη στο γονίδιο ΤΚ που αλλάζει την εξειδίκευση του ενζύμου ως προς το υπόστρωμά του, οπότε δεν αναγνωρίζει πλέον το νουκλεοσιδικό ανάλογο που πρέπει να φωσφορυλιώσει (ΤΚ altered στελέχη)9. γ) Μετάλλαξη στην ιική DNA πολυμεράση, η οποία δεν αναγνωρίζει πλέον την τριφωσφορική μορφή των φαρμάκων, αλλά αναγνωρίζει τα φυσικά τριφωσφορικά νουκλεοτίδια, επιτρέποντας έτσι τη γρήγορη αναπαραγωγή του ιού. Και οι δύο τελευταίες μεταλλάξεις είναι εξαιρετικά σπάνιες9. Γενικά, η αντοχή στα φάρμακα παρουσιάζεται κυρίως στους ανοσοκατασταλμένους. Υπολογίζεται ότι τα ανθεκτικά στην ακυκλοβίρη/πενσικλοβίρη στελέχη του απλού έρπητα αποτελούν το 5-10% του συνόλου σε ασθενείς με AIDS και σε μεταμοσχευμένους με μυελό των οστών10. Έρπης ζωστήρ ανθεκτικός στην ακυκλοβίρη έχει περιγραφεί επίσης σε ασθενείς με AIDS11. Διασταυρούμενη αντοχή και αντοχή σε πολλαπλά φάρμακα του απλού έρπητα έχει 130 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία τεκμηριωθεί12. Μόνο μια περίπτωση μετάδοσης έρπητα ανθεκτικού στην ακυκλοβίρη έχει καταγραφεί μέχρι σήμερα13. Σε τέτοιες περιπτώσεις ανθεκτικών ιών, η θεραπεία διακόπτεται και χορηγείται φοσκαρνέτη, η οποία δρα απευθείας στην πολυμεράση, χωρίς να εξαρτάται από την ΤΚ. Στον κυτταρομεγαλοϊό η εμφάνιση αντοχής στην κλινική πράξη σχετίζεται κυρίως με τη χορήγηση γκανσικλοβίρης είτε προφυλακτικά από τη μεταμόσχευση και μετά, είτε για προληπτική θεραπεία. Η αντοχή έχει μεγαλύτερη συχνότητα στην πρώτη περίπτωση. Οι μεταλλάξεις αντοχής βρίσκονται κυρίως στην πρωτεΐνη UL97 και είναι είτε υποκαταστάσεις αμινοξέων, είτε μικρές (1- έως 17-αμινοξέα) μεταλλάξεις εξάλειψης στα κωδικόνια 460 και 520 ή στην περιοχή που ορίζεται από τα κωδικόνια 590 έως 607, που σχετίζονται με τη σύνδεση του ΑTP και την αναγνώριση του υποστρώματος αντίστοιχα. Μόνο λίγες υποκαταστάσεις αμινοξέων που σχετίζονται ενδεχομένως με την αντοχή στην γκανσικλοβίρη έχουν αναφερθεί σε άλλα σημεία της πρωτεΐνης14. Η δεύτερη ιική πρωτεΐνη που αφορά στην αντοχή του κυτταρομεγαλοϊού σε όλα τα αντιιικά είναι η ιική DNA πολυμεράση (pUL54). Οι δύο κύριες ενζυμικές λειτουργίες της πολυμεράσης είναι ο πολυμερισμός και η 3΄- 5΄ δραστηριότητα εξωνουκλεάσης. Η τριφωσφορική γκανσικλοβίρη, η τριφωσφορική βιδαραβίνη και η διφωσφορική σιδοφοβίρη, δρουν ως εναλλακτικά υποστρώματα για την ιική DNA πολυμεράση, οπότε οι πιθανοί μηχανισμοί αντοχής για τα παραπάνω αντι-ιικά είναι οι εξής τρεις: α) μειωμένη συγγένεια του ενζύμου για τον αναστολέα, β) μειωμένη εκλεκτική ενσωμάτωση του αναστολέα στην ιική αλυσίδα DNA που επιμηκύνεται, ή γ) εκλεκτική απομάκρυνση από την αλυσίδα DNA των ενσωματωμένων αναστολέων. Στην περίπτωση της φοσκαρνέτης, που δεν ενσωματώνεται στην ιική αλυσίδα DNA, ισχύει μόνο ο πρώτος μηχανισμός αντοχής15. Ανάμεσα στις πιο συχνές μεταλλάξεις της DNA πολυμεράσης είναι οι V715M, V781I και L802M, οι οποίες ευθύνονται για αντοχή στη φοσκαρνέτη και οι F412C, L501I/ F και P522S, που ευθύνονται για αντοχή σε γκανσικλοβίρη και ακυκλοβίρη. Η μετάλλαξη A809V, που ευθύνεται για αντοχή σε γκανσικλοβίρη και φοσκαρνέτη είναι επίσης συχνή. Κάποιες μεταλλάξεις (E756K και V812L και οι εξαλείψεις των κωδικονίων 981 και 982) σχετίζονται με αντοχή και στα τρία αντι-ιικά. Θεραπεία επιλογής για τα ανθεκτικά στην γκανσικλοβίρη στελέχη κυτταρομεγαλοϊού, παραμένει η φοσκαρνέτη16. Iός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας Όλα τα αντιρετροϊκά φάρμακα δεν είναι αρκετά ισχυρά όταν χρησιμοποιούνται ως μονοθεραπεία, διότι γρήγορα ο ιός αναπτύσσει αντοχή, οπότε κλινικό όφελος υπάρχει μόνο όταν γίνεται συνδυαστική θεραπεία. Η αποκαλούμενη αντιρετροϊκή θεραπεία μεγάλης αποτελεσματικότητας (HAART), περιλαμβάνει σήμερα έξι ευδιάκριτες κατηγορίες εγκεκριμένων για τη θεραπεία φαρμάκων (Εικόνα 2): α) Νουκλεοσιδικοί και νουκλεοτιδικοί αναστολείς ανάστροφης μεταγραφάσης (NRTIs). Νουκλεοσιδικά και νουκλεοτιδικά ανάλογα, φωσφορυλιωμένα από τα κυτταρικά ένζυμα, τα οποία ενεργούν ως τερματιστές της σύνθεσης της ιικής DNA αλυσίδας και εμποδίζουν την ανάστροφη μεταγραφή του ιικού RNA γονιδιώματος σε DNA17. Υπάρχουν οκτώ φάρμακα στην κατηγορία των NRTIs: ζιδοβουδίνη, διδανοσίνη, ζαλσιταβίνη, σταβουδίνη, λαμιβουδίνη, αβακαβίρη, τενοφοβίρη και εμτρισιταβίνη. β) Μη νουκλεοσιδικοί αναστολείς ανάστροφης μεταγραφάσης (ΝΝRΤΙs). Αρωματικά, πολυκυκλικά μόρια που δεσμεύουν και εμποδίζουν την ανάστροφη μεταγραφάση 17. Υπάρχουν τέσσερα φάρμακα στην κατηγορία των NNRTIs: νεβιραπίνη, δελαβιρδίνη, ετραβιρίνη και εφαβιρένζη. γ) Αναστολείς της πρωτεάσης (PIs). Μικρά, πεπτιδικά κλάσματα που δεσμεύουν αμετάκλητα στην ενεργό περιοχή της ιικής πρωτεάσης, ε- Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 ΑΝΑΣΤΡΟΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ Εικόνα 2. Κύκλος ζωής του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας και στόχοι των αντιρετροϊκών φαρμάκων (τροποποίηση από www.aidseducator. org/.../106-HIV-Life-Cycle.html). 1. Ελεύθερος ιός 2. Προσκόλληση του ιού στην επιφάνεια του κυττάρου μέσω του CD4 και του CCR5 ή CXCR4. Δράση από αναστολείς εισόδου και σύντηξης 3. Μόλυνση του κυττάρου με απελευθέρωση του ιικού RNA 4. Ανάστροφη μεταγραφή του ιικού RNA σε DNA μέσω της ανάστροφης μεταγραφάσης. Δράση από αναστολείς της ανάστροφης μεταγραφάσης 5. Ενσωμάτωση του ιικού DNA στο χρωμόσωμα του κυττάρου ξενιστή με τη μεσολάβηση της ιντεγκράσης. Δράση από αναστολείς ιντεγκράσης 6. Μεταγραφή του ιικού DNA σε mRNA και σύνθεση των πρωτεϊνών του ιού 7. Συγκέντρωση των ιικών πρωτεϊνών και των ιικών RNA γονιδιωμάτων σε νέα ιικά σωμάτια που είναι έτοιμα να βγουν από το κύτταρο 8. Έξοδος με σχηματισμό του ελύτρου του ιού 9. Ωρίμαση του ιού με τη δράση της πρωτεάσης, η οποία κόβει τις πρωτεϊνικές αλυσίδες και προκύπτουν οι ιικές πρωτεΐνες. Δράση από αναστολείς πρωτεάσης. μποδίζοντας την ενζυμική κατάτμηση των ιικών πρωτεϊνικών προδρόμων17. Υπάρχουν εννιά φάρμακα στην κατηγορία των PIs: σακουϊναβίρη, ινδιναβίρη, ριτοναβίρη, νελφιναβίρη, αμπρεναβίρη, λοπιναβίρη, αταζαναβίρη, δαρουναβίρη και τιπραναβίρη. 131 δ) Αναστολείς σύντηξης (FIs). Ο αναστολέας σύντηξης ενφουβιρτίδη δεσμεύει την HR1 περιοχή της γλυκοπρωτεϊνης gp41, η οποία είναι υπεύθυνη για τη σύντηξη του ελύτρου του ιού με την κυτταρική μεμβράνη του κυττάρουξενιστή (κύτταρα που εκφράζουν τον CD4 υποδοχέα)17. ε) Αναστολείς εισόδου (ΕIs): το φάρμακο μαραβιρόση, το οποίο εμποδίζει την είσοδο του ιού στο κύτταρο-ξενιστή, δρώντας ανταγωνιστικά στον υποδοχέα β χημειοκινών CCR5, ο οποίος είναι ο συνυποδοχέας του ιού στο κύτταρο-ξενιστή17. στ) Αναστολείς ιντεγκράσης (IIs): το φάρμακο ραλτεγκραβίρη, το οποία δρα εμποδίζοντας την ιική ιντεγκράση, η οποία ενσωματώνει το διπλής έλικας DNA του ιού στο χρωμόσωμα του κυττάρου-ξενιστή17. Οι στόχοι της HAART είναι η καταστολή της αναπαραγωγής του ιού και η επακόλουθη παράταση της επιβίωσης των υπό θεραπεία ασθενών με HIV. Εντούτοις, αυτά τα οφέλη αναστέλλονται από την ανάπτυξη αντοχής στα αντιρετροϊκά φάρμακα. Ο συνεχής, υψηλού επιπέδου πολλαπλασιασμός του ιού in vivo (10 7 κύκλοι αναπαραγωγής ανά ημέρα) και το έμφυτο ποσοστό λάθους της ανάστροφης μεταγραφάσης (3X10-5 μεταλλάξεις ανά κύκλο αναπαραγωγής), μαζί με την υψηλή συχνότητα του γενετικού ανασυνδυασμού, έχουν ως αποτέλεσμα τη γένεση HIV πληθυσμών που είναι ιδιαίτερα ετερογενείς (quasispecies). Κατά συνέπεια, ο HIV είναι σε θέση να παρακάμψει γρήγορα την ανοσιακή απάντηση του ξενιστή και να αναπτύξει αντοχή στα φάρμακα18. Οι μεταλλάξεις διαιρούνται σε πρωτεύουσες ή βασικές και δευτερεύουσες ή βοηθητικές. Οι πρωτεύουσες μεταλλάξεις προκαλούν αντοχή με την τροποποίηση των λειτουργικών ιδιοτήτων των ενζύμων στόχων. Οι δευτερεύουσες μεταλλάξεις δεν προκαλούν αντοχή, αλλά ρυθμίζουν τα επίπεδα αντοχής με την πρόκληση διαμορφωτικών τροποποιήσεων που αντισταθμίζουν τα ελλείμματα που προκαλούνται από τις πρωτεύουσες μεταλλάξεις. 132 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Πολλές μεταλλάξεις προκαλούν διασταυρούμενη αντοχή στα φάρμακα μιας συγκεκριμένης κατηγορίας (ιδίως οι ΝΝRΤΙs έχουν χαμηλό φραγμό αντοχής), ενώ η συσσώρευση πολλαπλών μεταλλάξεων στις διαφορετικές πρωτεΐνες στόχους, μπορεί να προκαλέσει αντοχή σε πολλά διαφορετικά φάρμακα που ανήκουν σε διαφορετικές κατηγορίες αντιρετροϊκών. Οι μεταλλάξεις επιδρούν βλαπτικά στη φυσική κατάσταση (fitness) του ιού και επομένως στην ικανότητα πολλαπλασιασμού, τη λοιμικότητα και εξέλιξη της νόσου19. Ένα από τα πιο σοβαρά προβλήματα που προκύπτουν από την αντοχή, είναι η μετάδοση ανθεκτικών στελεχών του ιού20. Η αντοχή αντιμετωπίζεται με εναλλακτικές θεραπευτικές αγωγές, αλλά θα μπορούσε να αποτραπεί εάν υπήρχε πιο ισχυρή θεραπεία ή/και εάν τα φάρμακα ήταν εκλεκτικότερα έτσι ώστε να μπορούν να χορηγηθούν σε υψηλότερες δόσεις. Τα πρόσφατα αποτελέσματα με τον αναστολέα ιντεγκράσης παρουσιάζουν πολύ γρηγορότερη καταστολή του HIV RNA, η οποία προσφέρει την προοπτική για καθυστέρηση στην εμφάνιση αντοχής όταν η αρχική θεραπεία ασθενών που δεν έχουν λάβει προηγουμένως αντιρετροϊκά, περιλαμβάνει έναν αναστολέα ιντεγκράσης21. Δυστυχώς, οι ανθεκτικοί γονότυποι του ιού μπορούν να παραμείνουν στα κύτταρα -ξενιστές με τη μορφή του προ-ιικού DNA, από την οποία επανενεργοποιούνται πολλά χρόνια μετά22. Ιοί ηπατίτιδας Β και C H θεραπεία της χρόνιας ηπατίτιδας Β περιλαμβάνει σήμερα εκτός από την αρχικά χρησιμοποιούμενη ιντερφερόνη άλφα και τη χορήγηση των νουκλεοσιδικών/νουκλεοτιδικών αναλόγων. Ένα στάδιο της αναπαραγωγής του ιού περιλαμβάνει μια ανάστροφη μεταγραφάση όμοια με αυτή των ρετροϊών, οπότε κάποια από τα φάρμακα με δράση κατά του HIV, έχουν δράση και κατά του ιού της ηπατίτιδας Β. Η ιντερφερόνη άλφα είναι μία φυσική γλυκοπρωτεΐνη που εκκρίνεται από τα κύτταρα όταν υπάρχει ιική λοίμωξη και έχει μη ειδική αντι-ιική και ανοσοτροποποιητική δράση. Δρα δεσμεύοντας έναν υποδοχέα μεμβράνης. Η δέσμευση του υποδοχέα ξεκινάει μία σειρά από ενδοκυτταρικά σήματα που τελικά οδηγούν σε αυξημένη έκφραση κάποιων γονιδίων. Αυτό οδηγεί στην αύξηση και στην επαγωγή ορισμένων κυτταρικών δραστηριοτήτων, συμπεριλαμβανομένης της αύξησης της καταστροφής των κυττάρων-στόχων από τα λεμφοκύτταρα και της παρεμπόδισης της αναπαραγωγής των ιών στα μολυσμένα κύτταρα23. Τα νουκλεοσιδικά/ νουκλεοτιδικά ανάλογα εμποδίζουν την ανάστροφη μεταγραφή του RNA προγενώματος του ιού σε DNA, προκαλώντας τον τερματισμό της σύνθεσης του ιικού DNA με ενσωμάτωση συνθετικών νουκλεοτιδίων (Εικόνα 3). Αρχικά κλινική εμπειρία υπήρχε μόνο με τη λαμιβουδίνη, που ήταν το μόνο εγκεκριμένο φάρμακο για πολλά χρόνια. Η λαμιβουδίνη ως μονοθεραπεία, εμφανίζει ισχυρή αντι-ιική δράση έναντι του ιού με αποτέλεσμα σημαντικού βαθμού ιική καταστολή και συνεπακόλουθη βιοχημική και ιστολογική ύφεση της νόσου στην πλειονότητα των ασθενών. Ωστόσο, αντοχή εμφανίζεται μετά από κάποιο χρονικό διάστημα σε όλους σχεδόν τους ασθενείς, λόγω μεταλλάξεων στην ανάστροφη μεταγραφάση του ιού και κυρίως στην καλά διατηρημένη αλληλουχία YMDD, το καταλυτικό σημείο του ενζύμου24. Άλλα νουκλεοσιδικά/νουκλεοτιδικά ανάλογα με ισχυρή δράση είναι η αδεφοβίρη, η τενοφοβίρη, η τελμπιβουδίνη και η εντεκαβίρη. Η εμφάνιση αντοχής στη λαμιβουδίνη μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο αντοχής σε όλα σχεδόν τα άλλα αντι-ιικά με σταδιακή συσσώρευση μεταλλάξεων αντοχής, ακόμα και στην αδεφοβίρη και την εντεκαβίρη που είναι αποτελεσματικές στην αντιμετώπιση των ανθεκτικών στη λαμιβουδίνη στελεχών2. Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω, θα πρέπει να αποφεύγεται η μονοθεραπεία με λαμιβουδίνη ως αρχική θεραπεία για τον ιό. Ό- Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 133 Εικόνα 3. Κύκλος ζωής του ιού της ηπατίτιδας Β και στόχοι των αντι-ιικών φαρμάκων (τροποποίηση από www.chuv.ch/imul/imu-hbvlifecycle-5.jpg). 1. Προσκόλληση του ιού στο ηπατοκύτταρο μέσω του κυτταρικού υποδοχέα 2. Μετάβαση του νουκλεοκαψιδίου στο κυτταρόπλασμα 3. Απελευθέρωση του ιικού DNA στον πυρήνα όπου μετατρέπεται σε ένα κλειστό, κυκλικό DNA (cccDNA) 4. Μεταγραφή σε RNA 5. Τα ιικά mRNAs μεταφράζονται σε πρωτεΐνες στο κυτταρόπλασμα 6-7. Το RNA προγένωμα μαζί με την ανάστροφη μεταγραφάση (RT) ενθυλακώνονται σε ένα καψίδιο που αποτελείται από την πρωτεΐνη core 9. Σύνθεση ιικού DNA από το RNA προγένωμα με τη βοήθεια της ανάστροφης μεταγραφάσης. Δράση από αναστολείς της ανάστροφης μεταγραφάσης. Τα νεοσύστατα νουκλεοκαψίδια που προκύπτουν μπορούν είτε να απελευθερώσουν το ιικό DNA στον πυρήνα αρχίζοντας έναν νέο κύκλο σύνθεσης cccDNA, είτε (10) να αποκτήσουν έλυτρο στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) και τα σωμάτια Golgi και να απελευθερωθούν (11) οι ώριμοι ιοί από το μολυσμένο κύτταρο με εξωκυττάρωση. σον αφορά στη συνδυαστική θεραπεία, ο συνδυασμός πεγκυλιωμένης ιντερφερόνης-α2Α και λαμιβουδίνης δεν είχε κάποιο πλεονέκτημα25. Παρομοίως και η τελμπιβουδίνη σε συνδυασμό με την λαμιβουδίνη26. Αντιθέτως, ο συνδυασμός λαμιβουδίνης και αδεφοβίρης είχε πλεονεκτήματα ως προς το μειωμένο ιικό φορτίο και στην αύξηση του χρόνου που απαιτείται για την ανάπτυξη αντοχής27. Ο ιός της ηπατίτιδας Β είναι μικρός και συμπαγής και τα γονίδια που κωδικοποιούν την ανάστροφη μεταγραφάση και το αντιγόνο επιφανείας επικαλύπτονται. Έτσι, οι μεταλλάξεις αντοχής στην ανάστροφη μεταγραφάση μπορεί να μεταβάλουν τη δομή του αντιγόνου επιφανείας28 με συνέπειες στην αποτελεσματικότητα του εμβολίου (τα εμβόλια του ιού της ηπατίτιδας Β διεγείρουν χυμική ανοσιακή απάντηση με παραγωγή αντισωμάτων έναντι επίτοπων του αντιγόνου επιφάνειας). Έτσι, απαιτείται προσεκτικός έλεγχος των ανθεκτικών στελεχών του ιού ηπατίτιδας Β, καθώς η χρήση των φαρμάκων αυξάνεται. Ο ιός της ηπατίτιδας C (HCV) κάνει χρόνια λοίμωξη κατά τη διάρκεια της οποίας ο ιός αναπαράγεται διαρκώς. Ο HCV διαθέτει γρήγορο πολλαπλασιασμό και η HCV-RΝΑ-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση (NS5B), το ένζυμο αρμόδιο για την αντιγραφή του γονιδιώματος του HCV, είναι επιρρεπής σε λάθη ελλείψει μηχανισμών διόρθωσης. Η τρέχουσα θεραπεία για τη χρόνια λοίμωξη από τον ιό είναι πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη μόνη ή σε συνδυασμό με ριμπαβιρίνη. Το ποσοστό αποτελεσματικότητας ποικίλλει, ανάλογα με τους ιικούς γονότυπους. Οι περισσότερες μελέτες δείχνουν ότι οι γονότυποι 1a και 1b είναι οι ανθεκτικότεροι από τους γονοτύπους τύπου 1, σε οποιαδήποτε θεραπεία βασισμένη σε ιντερφερόνη άλφα29. Η φυσική αντοχή μερικών στελεχών του ιού στην ιντερφερόνη έχει αποδοθεί στην ιική μη δομική πρωτεΐνη NS5A και στην πρωτεΐ- 134 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία νη του ελύτρου E2, οι οποίες αδρανοποιούν την R πρωτεϊνική κινάση της οποίας η παραγωγή επάγεται από την ιντερφερόνη 30. Η ενεργοποίηση της ιντερλευκίνης 8 έχει αποδειχθεί επίσης ότι συμβάλλει στην αντοχή στην ιντερφερόνη31. Η ριμπαβιρίνη, ένα ριβινουκλεοσιδικό ανάλογο, θεωρείται ότι έχει άμεση αντι-ιική δράση λόγω της δυνατότητάς του να εμποδίζει τη σύνθεση του RNA διάφορων RNA ιών. Εντούτοις, η ριμπαβιρίνη ως μονοθεραπεία κατά του ιού της ηπατίτιδας C δεν επέδειξε αντιιική δραστηριότητα στις κλινικές δοκιμές και κατά συνέπεια, θεωρείται γενικά ότι δρα ως ανοσοτροποποιητής ή ότι αυξάνει την μεταλλαξιογένεση στο RNA και με αυτές τις ενέργειες συμβάλλει στη μείωση της μολυσματικότητας του ιού32-33. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός της κλινικής δράσης της ριμπαβιρίνης παραμένει ασαφής. Η γονοτυπική ανάλυση στελεχών του ιού πριν και μετά από μονοθεραπεία με ριμπαβιρίνη έδειξε μόνο δευτερεύουσες μεταλλάξεις ως αποτέλεσμα της θεραπείας, εντούτοις, ανιχνεύτηκε μια συγκεκριμένη μετάλλαξη στην περιοχή της NS5B RNA πολυμεράσης του γονοτύπου 1a του ιού. Η μετάλλαξη είναι στην περιοχή δέσμευσης του υποστρώματος της πολυμεράσης. Όταν αυτή η μετάλλαξη εισήχθη σε υπογενωμικά ρεπλικόνια του ιού in vitro, τα τελευταία παρουσίασαν ενισχυμένη αντoχή στη ριμπαβιρίνη34. Αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι η ριμπαβιρίνη μπορεί να λειτουργήσει και ως άμεσο αντι-ιικό in vivo. Γενικότερα, οι λόγοι για τη μειωμένη ανταπόκριση του ιού της ηπατίτιδας C στη θεραπεία (πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη με ή χωρίς ριμπαβιρίνη), περιλαμβάνουν ιολογικούς παράγοντες, γενετικούς παράγοντες, φαρμακοκινητικούς και φαρμακοδυναμικούς παράγοντες, και ανοσοκατασταλτικούς παράγοντες, όπως αυτούς που προκύπτουν από τη θεραπεία μετά από μεταμόσχευση οργάνων ή από συλλοίμωξη με HIV35. Νέα φάρμακα κατά του ιού, αναστολείς της ιικής πρωτεάσης, πολυμεράσης και ελικάσης, είναι σε φάση κλινικών δοκιμών ή αναμένουν έγκριση. Ιοί της γρίπης Δύο κατηγορίες αντι-ιικών φαρμάκων είναι διαθέσιμες αυτήν την περίοδο για την αντιμετώπιση των ιών της γρίπης: οι αναστολείς του δίαυλου Μ2 (η αμανταδίνη και η ριμανταδίνη που δεν κυκλοφορεί στην Ελλάδα) και οι αναστολείς της νευραμινιδάσης (η οσελταμιβίρη και η ζαναμιβίρη) (Εικόνα 4). Οι αναστολείς του δίαυλου Μ2 είναι ενεργοί μόνο έναντι των ιών γρίπης Α και χρησιμοποιούνται και στη θεραπεία και στη χημειοπροφύλαξη της γρίπης Α, ενώ οι αναστολείς της νευραμινιδάσης είναι ενεργοί έναντι των ιών γρίπης Α και Β. Η πρωτεΐνη Μ2 σχηματίζει έναν ιοντικό δίαυλο στο έλυτρο του ιού, ο οποίος επιτρέπει ιόντα υδρογόνου να μπουν στο βιριόνιο από το ενδόσωμα, κάνοντας έτσι πιο όξινο το pH στο εσωτερικό του ιού, οπότε αποσυνδέεται η ιική πρωτεΐνη Μ1 από το RNA του ιού και ο ιός αποβάλλει το έλυτρο (έκδυση). Οι αναστολείς του δίαυλου Μ2 εγκαθίστανται στον ιοντικό δίαυλο και εμποδίζουν την είσοδο των πρωτονίων. Έτσι, αντοχή σ’ αυτή την κατηγορία φαρμάκων εμφανίζεται κατόπιν σημειακών μεταλλάξεων στην πρωτεΐνη Μ2, οι οποίες εμποδίζουν την εγκατάσταση του φαρμάκου και τη δράση του ως πύλης36. Η αντοχή του ιού της γρίπης Α στους αναστολείς του δίαυλου Μ2 μπορεί να εμφανιστεί αφ’ εαυτής ή να προκύψει σύντομα κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Μια σημειακή μετάλλαξη στα κωδικόνια για τα αμινοξέα στις θέσεις 26, 27, 30, 31, ή 34 της πρωτεΐνης Μ2 μπορεί να προκαλέσει διασταυρούμενη αντοχή σε αμανταδίνη και ριμανταδίνη. Ούτε η αναπαραγωγή, ούτε η μετάδοση, ούτε και η λοιμικότητα των αμανταδίνη-ανθεκτικών ιών της γρίπης Α εξασθενίζουν από τις σημειακές μεταλλάξεις αντοχής37. Η νευραμινιδάση αποσυνδέει την ιική αιμοσυγκολλητίνη από τους κυτταρικούς υποδοχείς σιαλικού οξέος, επιτρέποντας έτσι στα νεοσχηματισμένα ιικά σωμάτια να βγουν από την επιφάνεια του κυττάρου 36. Μεταλλάξεις στη νευραμινιδάση ή στην αιμοσυγκολλητίνη, Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 135 Εικόνα 4. Κύκλος ζωής του ιού της γρίπης και στόχοι των αντι-ιικών φαρμάκων (τροποποίηση από http:csb.yonsei.ac.kr/1158). 1. Δέσμευση του ιού από υποδοχέα σιαλικού οξέος (Ν: νευραμινιδάση, Η: αιμοσυγκολλητίνη, Μ2: πρωτεΐνη Μ2) 2. Ενδοκυττάρωση του ιού από την κυτταρική μεμβράνη και μεταφορά στο ενδόσωμα. Δράση από αναστολείς διαύλου Μ2 3. Έκδυση. Ο ιός αποβάλλει το έλυτρο μετά από σύντηξη με τη μεμβράνη του ενδοσώματος, υποβοηθούμενος από το όξινο pH 4. Μεταφορά του ιικού RNA στον πυρήνα, σύνθεση του mRNA και πολλαπλασιασμός του ιικού RNA 5. Σύνθεση των πρωτεϊνών του ιού στο κυτταρόπλασμα (εσωτερικές πρωτεΐνες) και στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ΕR) (πρωτεΐνες μεμβράνης) 6. Σχηματισμός του ελύτρου του ιού και έξοδος από το κύτταρο 7. Απελευθέρωση από την επιφάνεια του κυττάρου με την συμβολή της νευραμινιδάσης. Δράση από αναστολείς της νευραμινιδάσης. μειώνουν τη συγγένειά της αιμοσυγκολλητίνης ως προς το σιαλικό οξύ, ελαττώνοντας έτσι την ανάγκη του ιού για τη λειτουργική δραστηριότητα της νευραμινιδάσης και οδηγώντας στην εμφάνιση αντοχής στους αναστολείς νευραμινιδάσης. Σε αντίθεση με την αντοχή στους αναστολείς του δίαυλου Μ2, η αντοχή στους αναστολείς νευραμινιδάσης παραμένει σπάνια παγκοσμίως. Μεταλλάξεις στα κωδικόνια 119, 152,198, 274, 275 και 292 στην ενεργό περιοχή της νευραμινιδάσης, σχετίζονται με αντοχή. Οι μεταλλάξεις στα «καταλυτικά» κωδικόνια 292 και 152 προκαλούν διασταυρούμενη αντοχή σε οσελταμιβίρη και ζαναμιβίρη38. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων χρόνων, τα στελέχη του υποτύπου Η3Ν2 του ιού της γρίπης Α παρουσιάζουν υψηλό ποσοστό αντοχής στους αναστολείς του διαύλου Μ239. Από τον Ιανουάριο του 2008, τα στελέχη του εποχικού υποτύπου Η1Ν1, παρουσίασαν μεγάλη αύξηση της αντοχής στην οσελταμιβίρη. Το φαινόμενο αυτό, δεν σχετίζεται με εκτεταμένη χρήση της οσελταμιβίρης και παραμένει ανεξήγητο40. Η οσελταμιβίρη παραμένει το φάρμακο που συστήνεται από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας για την αντιμετώπιση της γρίπης από στελέχη του υποτύπου της γρίπης Α H5N1(γρίπη των πτηνών). Μόνο από έναν πολύ μικρό αριθμό ασθενών παγκοσμίως απομονώθηκαν ανθεκτικά στην οσελταμιβίρη στελέχη Η5Ν1. Αυτοί οι ιοί δεν μεταδόθηκαν σε άλλους41. Στην οσελταμιβίρη επίσης παραμένουν ευαίσθητα τα στελέχη του υποτύπου Η3Ν2 και ο ιός της γρίπης Β και στη ζαναμιβίρη τα στελέχη του υποτύπου Η3Ν2 και του εποχικού υποτύπου Η1Ν1 της γρίπης Α και ο ιός της γρίπης Β41. Σύμφωνα με τα τελευταία στοιχεία του CDC για το 2009, από τα πανδημικά στελέχη του υποτύπου Η1Ν1 (που είναι διαφορετικά από αυτά του εποχικού Η1Ν1 υποτύπου) που απομονώθηκαν, το 98% ήταν ευαίσθητα στην οσελταμιβίρη και το 100% ήταν ευαίσθητα στη ζαναμιβίρη. Οι αναστολείς του διαύλου Μ2 δεν έχουν καμία δράση στο πανδημικό στέλεχος. 136 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Τέλος, έχει συζητηθεί η πιθανότητα χρήσης συνδυασμού φαρμάκων κατά της γρίπης για την αντιμετώπιση της αντοχής42, αλλά δεν υπάρχουν ακόμα έγκυρα αποτελέσματα από τις κλινικές δοκιμές. Εργαστηριακός έλεγχος αντοχής: γονοτυπικές και φαινοτυπικές δοκιμασίες Η δοκιμή ευαισθησίας στα αντι-ιικά φαρμάκα έχει γίνει ένα σημαντικό κομμάτι της αντι-ιικής θεραπείας και είναι συχνά ουσιαστική για την κατάλληλη αντιμετώπιση των χρόνιων ιικών παθήσεων, αλλά και για την αποφυγή της μετάδοσης ανθεκτικών ιών και τη μελλοντική ανακάλυψη νέων φαρμάκων. Για τον έλεγχο της αντοχής, δύο ειδών δοκιμασίες χρησιμοποιούνται: οι γονοτυπικές και οι φαινοτυπικές. Οι γονοτυπικές δοκιμασίες ανιχνεύουν στο ιικό γονιδίωμα τις μεταλλάξεις που σχετίζονται με αντοχή. Η διδεοξυνουκλεοτιδική ανάλυση της γενετικής αλληλουχίας (sequencing) είναι η βασική μέθοδος προσδιορισμού και οι τρέχουσες εφαρμογές στηρίζονται σε αυτοματοποιημένη ανάλυση της γενετικής αλληλουχίας43. Οι γονοτυπικές δοκιμασίες είναι γρηγορότερες, πιο προσιτές, και λιγότερο δαπανηρές από τις φαινοτυπικές δοκιμασίες, εντούτοις έχουν διάφορους περιορισμούς. Η ανίχνευση μεταλλάξεων παρέχει μια έμμεση μέτρηση της ευαισθησίας στα φάρμακα και, επομένως, παρέχει πληροφορίες μόνο όταν συγκεκριμένες αλλαγές στη γενετική αλληλουχία έχουν ήδη χαρακτηριστεί και συσχετιστεί με την αντοχή στα φάρμακα. Επιπλέον, δεν επιτρέπουν την άμεση ερμηνεία των σύνθετων μεταλλάξεων αντοχής, της διασταυρούμενης αντοχής, της πολλαπλής αντοχής και των αλλαγών στην αντοχή. Οι περισσότερες γονοτυπικές δοκιμασίες δεν ανιχνεύουν τις γενετικές παραλλαγές του ιού, παρούσες σε ένα μικρό ποσοστό μόνο στο κλινικό δείγμα43. Οι φαινοτυπικές δοκιμασίες μετρούν αμέσως τη δυνατότητα του ιού για αναπαραγωγή παρουσία ενός φαρμάκου. Ειδικότερα, οι φαινοτυπικές δοκιμασίες καθορίζουν την ανασταλτική συγκέντρωση ενός αντι-ιικού φαρμάκου που μειώνει την ιική αντοχή κατά 50% (IC50) ή κατά 90% (IC90) στις κυτταροκαλλιέργειες. Η ευαισθησία του ιού συγκρίνεται έπειτα με αυτήν του ευαίσθητου στο φάρμακο ιού (wild type virus) ή με αυτήν του ιού που απομονώνεται από τον ίδιο ασθενή πριν από τη θεραπεία44. Για τους ερπητοϊούς, η δοκιμή ευαισθησίας στα φάρμακα είναι κατάλληλη για τους ασθενείς που δεν είχαν καλή ανταπόκριση στη θεραπεία πρώτης γραμμής. Ειδικά για τον κυτταρομεγαλοϊό, η δοκιμή συνιστάται σε όσους έχουν λάβει μονοθεραπεία για κάποια περίοδο (συνήθως μετά από 3-4 μήνες σε ασθενείς με AIDS και μετά από μακροχρόνια προφυλακτική θεραπεία σε μεταμοσχευμένους ασθενείς), ιδίως όταν υπάρχουν προδιαθεσικοί παράγοντες (μεταμόσχευση πνεύμονα ή νεφρού και AIDS με CD4 μετρήσεις <50 κύτταρα/µl). Επιπρόσθετα, όταν ο ενεργός ιικός πολλαπλασιασμός εμμένει (υψηλά ή αυξανόμενα επίπεδα DNAαιμίας, αντιγοναιμίας, ιαιμίας) κατά τη διάρκεια της θεραπείας, παρά τις υψηλές χορηγούμενες δόσεις ενδοφλέβιων αντι-ιικών. In-house γονοτυπικές και φαινοτυπικές δοκιμασίες είναι διαθέσιμες για τον απλό έρπητα, τον έρπητα ζωστήρα, και τον κυτταρομεγαλοϊό. Τα αντιδραστήρια του εμπορίου για την φαινοτυπική δοκιμασία αντοχής του απλού έρπητα και του κυτταρομεγαλοϊού, βασίζονται σε ένα σύστημα παράλληλων καλλιεργειών που χρησιμοποιεί κύτταρα αναφοράς που περιέχουν το γονίδιο της β-γαλακτοσιδάσης, για να ποσοτικοποιήσουν χρωμογονικά την ιική αύξηση45. Για τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας, ο έλεγχος αντοχής συνιστάται στην οξεία λοίμωξη, στην πρόσφατη λοίμωξη (<12 μήνες), στη χρόνια λοίμωξη πριν από την έναρξη της θεραπείας, σε αποτυχία της πρώτης θεραπείας (αδυναμία καταστολής του ιικού πολλαπλασιασμού μέσα σε 8-12 εβδομάδες), στην αποτυχία οποιουδήποτε θεραπευτικού σχήματος (≥1,000 Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 ιικά αντίγραφα/ml) και στην εγκυμοσύνη. Γονοτυπικές δοκιμασίες είναι διαθέσιμες στο εμπόριο 43. Οι τρεις υψηλά αυτοματοποιημένες φαινοτυπικές δοκιμασίες που είναι σήμερα διαθέσιμες από εξειδικευμένα ερευνητικά εργαστήρια [Antivirogram assay (Virco Lab, Titusville, NJ), PhenoSense assay (Virologic, South San Francisco, CA), Phenoscript (Spe cialt y Laboratories, Santa Monica, CA and VIRalliance, Paris, France)] βασίζονται σε ανασυνδυασμένους ιούς, οι οποίοι περιέχουν τα γονίδια των πρωτεϊνών-στόχων (πρωτεάση, ανάστροφη μεταγραφάση) που έχουν προκύψει από το πλάσμα ασθενών με PCR ανάστροφης μεταγραφής (RT-PCR). Τα τελευταία χρόνια ένας νέος τύπος δοκιμασιών έχει αναπτυχθεί για την ανάλυση της ικανότητας αναπαραγωγής (fitness, ικανότητα αναπαραγωγής του ιού σε συγκεκριμένο περιβάλλον) των ανθεκτικών ΗΙV στελεχών in vivo και in vitro46. Δεν είναι ακόμα γνωστό αν η εμφάνιση αντοχής και η επακόλουθη αλλαγή της ικανότητας αναπαραγωγής, μειώνει τη λοιμικότητα του ιού και κατά συνέπεια καθυστερεί την εξέλιξη της νόσου47. Μια τέτοια διαπίστωση, θα ήταν σημαντική για την αντιμετώπιση των ασθενών στους οποίους ο ιικός πολλαπλασιασμός δεν μπορεί να κατασταλεί. Η ανάλυση της ιικής ικανότητας αναπαραγωγής, μπορεί να αποδειχθεί σημαντική για την ερμηνεία της αντοχής του ιού στα αντιρετροϊκά. Για τον ιό της ηπατίτιδας Β, ο έλεγχος αντοχής συνιστάται σε περιπτώσεις θεραπευτικής αποτυχίας, αλλά και σε ασθενείς που πρόκειται να ξεκινήσουν θεραπεία, εφόσον ενδέχεται να είναι μολυσμένοι με ανθεκτικό στέλεχος του ιού. Οι γονοτυπικές και φαινοτυπικές δοκιμασίες αντοχής για τον ιό ακολουθούν την ίδια λογική των αντίστοιχων δοκιμασιών για τον ΗΙV48. Για τον ιό της γρίπης, ο έλεγχος αντοχής είναι περιορισμένης χρήσης λόγω της καθυστέρησης στη λήψη των αποτελεσμάτων. Εντούτοις, ορισμένοι ασθενείς μπορούν να ωφεληθούν, όπως είναι οι ανοσοκατασταλμένοι 137 ή οι ασθενείς της ΜΕΘ, οι ασθενείς που δεν δείχνουν κανένα σημάδι κλινικής βελτίωσης μετά από αντι-ιική θεραπεία 5 ημερών, αλλά και εκείνοι που ανέπτυξαν τη γρίπη ενώ ήταν υπό χημειοπροφύλαξη. Οι δοκιμασίες αντοχής περιλαμβάνουν την εξέταση αναστολής της νευραμινιδάσης για την ανίχνευση της αντοχής στην οσελταμιβίρη ή στη ζαναμιβίρη, που συνοδεύεται από ανάλυση της γενετικής αλληλουχίας του ιού για την ανίχνευση μεταλλάξεων που σχετίζονται με την αντοχή. Η αντοχή στους αναστολείς διαύλου Μ2 μπορεί να εντοπιστεί με ανάλυση της γενετικής αλληλουχίας του ιού για την ανίχνευση των γνωστών μεταλλάξεων αντοχής49. Αυτήν την περίοδο, οι δοκιμασίες εκτελούνται από το CDC, καθώς επίσης και από μερικά ερευνητικά εργαστήρια και μεμονωμένες περιπτώσεις εργαστηρίων δημόσιας υγείας. Σε πολλές περιπτώσεις, η κλινική χρησιμότητα των δοκιμασιών αντοχής δεν έχει αποδειχθεί. Διαρκές και εντατικό πεδίο έρευνας αποτελεί η εύρεση πιο αξιόπιστων κλινικών ορίων φαινοτυπικής αντοχής, ούτως ώστε να παρέχονται περισσότερες πληροφορίες για τη συσχέτιση φαινοτύπου και κλινικής ανταπόκρισης του ασθενούς και να εκτιμάται καλύτερα η πιθανή συμβολή οποιουδήποτε αντι-ιικού φαρμάκου σε μια θεραπεία πολλαπλών φαρμάκων. Συμπεράσματα Η εμφάνιση αντοχής έναντι οποιουδήποτε ειδικού και ισχυρού αντι-ιικού φαρμάκου είναι αναπόφευκτη. Έρευνα για την ανακάλυψη νέων αναστολέων γίνεται για όλες τις παραπάνω κατηγορίες ιών, αλλά και για άλλους πολύ σημαντικούς ιούς για τους οποίους δεν υπάρχουν αποτελεσματικά φάρμακα (όπως οι οκτώ ιοί της ηπατίτιδας και οι ιοί των ανθρώπινων θηλωμάτων). Η πρόσφατη πανδημία γρίπης με το μεταλλαγμένο στέλεχος του ιού Α, Η1Ν1, ενίσχυσε την ανάγκη για αντι-ιικά φάρμακα ευρέος φάσματος. Παράλληλα, αναμένονται τα αποτελέσματα των κλινικών δοκιμών για τα εμ- 138 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία βόλια κατά του HIV και του ιού της ηπατίτιδας C. Εξίσου σημαντική είναι η αναζήτηση νέων στρατηγικών για καλύτερη χρήση των φαρμάκων που ήδη υπάρχουν και μεγιστοποίηση των κλινικών αποτελεσμάτων. Χρειάζονται πολύ σαφείς διαγνωστικές και θεραπευτικές οδηγίες για τη χρήση των αντι-ιικών στην πρωτοβάθμια υγεία, όπως είναι οι περιπτώσεις της γρίπης και του έρπητα ζωστήρα. Οι απειλές για βιοτρομοκρατία θα οδηγήσουν στην αξιολόγηση φαρμάκων εναντίον της ευλογιάς και άλλων ιών. Κεντρικό πρόβλημα στην εμφάνιση αντοχής είναι η αδυναμία καταστολής του ιικού πολλαπλασιασμού και σε αυτό πρέπει να επικεντρωθεί και η έρευνα για την ανακάλυψη νέων φαρμάκων. Υποδειγματική είναι η περίπτωση του απλού έρπητα για την αντι-ιική χημειοθεραπεία, διότι έχει επιτευχθεί η αντιμετώπιση της λοίμωξης χωρίς ιδιαίτερα προβλήματα αντοχής, παρά την επί δεκαετίες έκθεση του ιού στην ακυκλοβίρη ή στην πενσικλοβίρη. Η ειδικότητα και η εκλεκτικότητα της δράσης των παραπάνω φαρμάκων, αλλά και το μεγάλο πλήγμα στην αναπαραγωγική ικανότητα, στη λοιμικότητα και στην ικανότητα μετάδοσης του ιού μετά από μετάλλαξη στη θυμιδινική κινάση, είναι κάποιοι από τους λόγους της θεραπευτικής επιτυχίας, έναντι των λοιμώξεων από έρπητα απλό. Οι ερευνητές μελετούν τη θεραπεία άλλων ιών βάσει του παραπάνω μοντέλου2. Η αντοχή στα αντι-ιικά φάρμακα είναι ζημιογόνος για το σύστημα Υγείας, για τον ασθενή που αποτυγχάνει να αποκομίσει το μέγιστο θεραπευτικό όφελος και για την κοινότητα στην οποία οι ανθεκτικοί ιοί μπορούν να μεταδοθούν. Υπάρχει επομένως επείγουσα ανάγκη για την αποτελεσματικότερη χρήση των δοκιμασιών αντοχής στα αντι-ιικά στην κλινική πράξη. Διεύθυνση Επικοινωνίας: Έλενα Κρανιωτάκη Μικροβιολογικό Τμήμα, Γ.Ν.Α. «Ο Ευαγγελισμός» e-mail: ekraniot@yahoo.com Summary Treatment of viral infections and antiviral drug resistance H. KRANIOTAKI1, E. PLATSOUKA2 1 Dept of Microbiology, Evangelismos Hospital, Athens, Greece 2 Dept of Microbiology, “Konstantopoulio” General Hospital Neas Ionias, Greece Applied Clinical Microbiology The development of antimicrobial agents (antibacterials and antivirals) to treat infections has been one of the most notable medical achievements of the past century. Effective antiviral therapy is the only hope for survival or alleviation of disease for millions of individuals worldwide suffering from chronic viral infection, including those caused by HIV, HBV and HCV. Despite considerable progress in the development of effective inhibitors directed at specific aspects of viral life cycles, therapeutic efficacy has been limited by the evolution of resistant virus. While such resistant viral isolates are of clinical significance primarily in immunocompromised individuals, the development and transmission of such mutants have been reported in immunocompetent persons as well. Novel and innovative approaches are needed to advance the basic field of study, providing a basis of knowledge for the development of new diagnostic, therapeutic or preventive approaches. (Key words: viral infections, antiviral resistance, molecular basis, genotypic and phenotypic tests). ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Pillay D, Zambon M. Antiviral drug resistance. BMJ 1998, 317: 660-662. 2. G riffiths PD. A perspective on antiviral resistance. J Clin Virol 2009, 46: 3-8. 3. Pillay D, Taylor S, Richman DD. Incidence and impact of resistance against approved antiretroviral drugs. Rev Med Virol 2000, 10: 231-253. Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 4. F yfe JA, Keller PM, Furman PA, Miller RL, Elion GB. Thymidine kinase from herpes simplex virus phosphorylates the new antiviral compound, 9-(2-hydroxyethoxymethyl) guanine. J Biol Chem 1978, 253: 8721–8727. 5. Prichard MN. Function of human cytomegalovirus UL97 kinase in viral infection and its inhibition by maribavir. Rev Med Virol 2009, 19: 215-229. 6. Schnipper LE, Crumpacker CS. Resistance of herpes simplex virus to acycloguanosine: role of viral thymidine kinase and DNA polymerase loci. Proc Natl Acad Sci USA 1980, 77: 2270-2273. 7. Vajpayee Μ., Malhotra Ν. Antiviral drugs against herpes infections. Indian Journal of Pharmacology 2000, 32: 330-338. 8. Morfin F, Thouvenot D. Herpes simplex virus resistance to antiviral drugs. J Clin Virol. 2003, 26: 29-37. 9. Bacon TH, Levin MJ, Leary JJ, Sarisky RT, Sutton D. Herpes simplex virus resistance to acyclovir and penciclovir after two decades of antiviral therapy. Clin Microbiol Rev 2003, 16: 114-128. 10. Pottage JC, Kersler HA. Herpes simplex virus resistance to aciclovir: clinical relevance. Infect Agents Dis 1995, 4: 115-124. 11.Saint-Léger E, Caumes E, Breton G, Douard D, Saiag P, Huraux JM, et al. Clinical and virologic characterization of acyclovir-resistant varicella-zoster viruses isolated from 11 patients with acquired immunodeficiency syndrome. Clin Infect Dis 2001, 33: 2061-2067. 12.Safrin S, Kemmerly S, Plotkin B, Smith T, Weissbach N, De Veranez D, et al. Foscarnet-resistant herpes simplex virus infection in patients with AIDS. J Infect Dis 1994, 169: 193-196. 13.Kost RG, Hill EL, Tigges M, Straus SE. Brief report: recurrent acyclovir-resistant genital herpes in an immunocompetent patient. N Engl J Med 1993, 329: 1777-1782. 14.Gilbert C, Boivin G. Human Cytomegalovirus Resistance to Antiviral Drugs. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49: 873-883. 15.Cihlar T, Fuller M, Cherrington J. Characterization of drug resistance-associated mutations in the human cytomegalovirus DNA polymerase gene by using recombinant mutant viruses generated from overlapping DNA fragments. J. Virol 1998, 72: 5927-5936. 16.Chou S, Lurain NS, Thompson KD, Miner RC, 139 Drew WL. Viral DNA polymerase mutations associated with drug resistance in human cytomegalovirus. J Infect. Dis 2003, 188: 32-39. 17.Potthoff AV, Brockmeyer NH. Current therapy of HIV. J Dtsch Dermatol Ges 2010, 8: 45-56. 18.Perelson AS, Neumann AU, Markowitz M, Leonard JM, Ho DD. HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time. Science 1996, 271: 15821586. 19.Clavel F, Race E, Mammano F. HIV drug resistance and viral fitness. Adv Pharmacol 2000, 49: 41-66. 20.Jakobsen MR, Tolstrup M, Søgaard OS, Jørgensen LB, Gorry PR, Laursen A, Ostergaard L. Transmission of HIV-1 drug-resistant variants: prevalence and effect on treatment outcome. Clin Infect Dis 2010, 50: 566-573. 21.Markowitz M, Nguyen BY, Gotuzzo E, Mendo F, RatanasuwanW, Kovacs C, et al. Rapid and durable antiretroviral effect of the HIV-1 Integrase inhibitor raltegravir as part of combination therapy in treatment-naive patients with HIV-1 infection: results of a 48-week controlled study. J Acquir Immune Defic Syndr 2007, 46: 125-133. 22.Williams SA, Greene WC. Regulation of HIV-1 latency by T-cell activation. Cytokine 2007, 39: 63-74. 23.Burke DC. The mechanism of interferon production. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1982, 299: 51-57. 24.Ghany MG, Doo EC. Antiviral resistance and hepatitis B therapy. Hepatology 2009, 49(5 Suppl): S174-184. 25.Lau GK, Piratvisuth T, Luo KX, Marcellin P, Thongsawat S, Cooksley G, et al. Peginterferon alfa-2a, lamivudine, and the combination for HBeAg-positive chronic hepatitis B. N Engl J Med 2005, 352: 2682-2695. 26.Lai CL, Leung N, Teo EK, Tong M, Wong F, Hann HW, et al. A 1-year trial of telbivudine, lamivudine, and the combination in patients with hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B. Gastroenterology 2005, 129: 528-536. 27.Sung JJ, Lai JY, Zeuzem S, ChowWC, Heathcote EJ, Perrillo RP, et al. Lamivudine compared with lamivudine and adefovir dipivoxil for the treatment of HBeAg-positive chronic hepatitis B. J Hepatol 2008, 48: 728-735. 140 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία 28.Pollicino T, Isgro G, Di Stefano R, Ferraro D, Maimone S, Brancatelliet S, et al. Variability of reverse transcriptase and overlapping S gene in hepatitis B virus isolates from untreated and lamivudine-resistant chronic hepatitis B patients. Antivir Ther 2009, 14: 649-654. 29.Legrand-Abravanel F, Colson P, LeguillouGuillemette H, Alric L, Ravaux I, Lunel-Fabiani F, et al. Influence of the HCV subtype on the virological response to pegylated interferon and ribavirin therapy. J Med Virol 2009, 81: 2029-2035. 30.Muñoz de Rueda P, Casado J, Patón R, Quintero D, Palacios A, Gila A, et al. Mutations in E2-PePHD, NS5A-PKRBD, NS5A-ISDR, and NS5A-V3 of hepatitis C virus genotype 1 and their relationships to pegylated interferon-ribavirin treatment responses. J Virol 2008, 82: 66446653. 31.Jia Y, Wei L, Jiang D, Wang J, Cong X, Fei R. Antiviral action of interferon-alpha against hepatitis C virus replicon and its modulation by interferon-gamma and interleukin-8. J Gastroenterol Hepatol 2007, 22: 1278-1285. 32.Ogbomo H, Michaelis M, Altenbrandt B, Doerr HW, Cinatl JJr. A novel immunomodulatory mechanism of ribavirin in suppressing natural killer cell function. Biochem Pharmacol 2010, 79: 188-197. 33.Chevaliez S, Brillet R, Lazaro E, Hezode C, Pawlotsky JM. Analysis of ribavirin mutagenicity in human hepatitis C virus infection. J Virol 2007, 81: 7732-7741. 34.Young KC, Lindsay KL, Lee KJ, Liu WC, He JW, Milstein SL, Lai MM. Identification of a ribavirin-resistant NS5B mutation of hepatitis C virus during ribavirin monotherapy. Hepatology 2003, 38: 869-878. 35.Reiberger T, Rasoul-Rockenschaub S, Rieger A, Ferenci P, Gangl A, Peck-Radosavljevic M. Efficacy of interferon in immunocompromised HCV patients after liver transplantation or with HIV co-infection. Eur J Clin Invest 2008, 38: 421-429. 36.Hayden FG. Antiviral resistance in influenza viruses—implications for management and pandemic response. N Engl J Med 2006, 354: 785788. 37.Hay AJ, Zambon MC, Wolstenholme AJ, Skehel JJ, Smith MH. Molecular basis of resistance of influenza A viruses to amantadine. J. Antimicrob. Chemother 1986, 18 Suppl B: 19-29. 38.Moscona A. Neuraminidase inhibitors for influenza. N Engl J Med 2005, 353: 1363-1373. 39.Furuse Y, Suzuki A, Kamigaki T, Shimizu M, Fuji N, Oshitani H. Reversion of influenza A (H3N2) virus from amantadine resistant to amantadine sensitive by further reassortment in Japan during the 2006-to-2007 influenza season. J Clin Microbiol 2009, 47: 841-844. 40.Kramarz P, Monnet D, Nicoll A, Yilmaz C, Ciancio B. Use of oseltamivir in 12 European countries between 2002 and 2007—lack of association with the appearance of oseltamivir-resistant influenza A(H1N1) viruses. Euro Surveill 2009, 14: 1-5. 41.Monto AS. Implications of antiviral resistance of influenza viruses. Clin Infect Dis. 2009, 48: 397399. 42.Poland GA, Jacobson RM, Ovsyannikova IG. Influenza virus resistance to antiviral agents: a plea for rational use. Clin Infect Dis 2009, 48: 1254-1256. 43.Shaffer RW. Genotypic testing for human immunodeficiency virus type 1 drug resistance. Clin Microb Rev 2002, 15: 247-277. 44.MacArthur RD. Understanding HIV phenotypic resistance testing: usefulness in managing treatment-experienced patients. AIDS Rev 2009, 11: 223-230. 45.Drew WL. Cytomegalovirus Resistance Testing: Pitfalls and Problems for the Clinician. Clin Infect Dis 2010. Epub ahead of print. 46.Quinones-Mateu ME, Arts EJ. HIV-1 fitness: implications for drug resistance, disease progression, and global epidemic evolution. In: HIV sequence compendium 2001. Kuiken C, Foley B, Hahn BH, Marx P, Mc Cutchan FE, Mellors J, et al. (editors). Los Alamos National Laboratory; pg 134-170. 47.Barbour JD, Grant RM. The clinical implications of reduced viral fitness. Curr Infect Dis Rep 2004, 6: 151-158. 48.Holness G, Carriero DC, Dieterich DT. Hepatitis B Therapies and Antiviral Resistance Detection and Management. Expert Rev Gastroenterol Hepatol 2009, 3: 693-699. 49.Deyde VM, Nguyen T, Bright RA, Balish A, Shu B, Lindstrom S, et al. Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 (H5N1) viruses using a pyrosequencing method. Antimicrob Agents Chemother 2009, 53: 10391047. 141 50.Edward J, Zabawski Jr. A Review of Topical and Intralesional Cidofovir. Dermatology Online Journal 2000, 6: 3. Υποβλήθηκε: 9/3/2010 Εγκρίθηκε: 14/7/2010 Από την Ιστορία Πώς η «μεταβιβάσιμη αντοχή» πέρασε στο χώρο της μουσικής Στο «Microbiology today», τεύχος 37: 3, Αύγουστος 2010, της Society for General Microbiology, ένας τίτλος με μεγάλα γράμματα «Transferable Resistance - A musical tribute to the Royal Society» τραβά το βλέμμα του αναγνώστη. Σύμφωνα με το σχόλιο που ακολουθεί, η Royal Society του Λονδίνου παρήγγειλε τη σύνθεση ενός μουσικού έργου ως εναρκτήριο στον εορτασμό της 350ής επετείου από της ιδρύσεώς της (1660). Η σύνθεση –ένα σύντομο εισαγωγικό μουσικό κομμάτι που γράφτηκε για χάλκινα πνευστά και μοιάζει με «φανφάρα»– ετοιμάστηκε και προγραμματίστηκε να παιχτεί, από τα χάλκικα πνευστά της Φιλαρμονικής Ορχήστρας του Λονδίνου, το απόγευμα της 30ής Ιουνίου 2010 στο Royal Festival Hall. Τον τίτλο της σύνθεσης «Transferable Resistance» τον έδωσε ο συνθέτης του, Julian Anderson, τρίτος γιος του E.S. Anderson, ως φόρο τιμής στην ερευνητική εργασία του πατέρα του, που συγκαταλέγεται μεταξύ των πρώτων Ευρωπαίων επιστημόνων που διερεύνησαν τη μεταβιβάσιμη αντοχή των μικροβίων στα αντιβιοτικά. Η σύνθεση αφιερώνεται στη μνήμη τριών επίτιμων μελών της Royal Society: του καθηγητού Max Delbrück, του καθηγητού Bill Hayes και του πατέρα του, καθηγητού E.S. Anderson, που συνδέονταν με φιλικό δεσμό με τους δύο προηγούμενους διάσημους επιστήμονες. Ο E.S. Anderson είχε εργασθεί στην αρχή της σταδιοδρομίας του στην Αίγυπτο και την Κύπρο και επισκέφθηκε αρκετές φορές την Ελλάδα δίνοντας διαλέξεις σε νοσοκομεία και στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών. Η Ελληνική Μικροβιολογική Εταιρεία τον είχε ανακηρύξει επίτιμο μέλος της, πριν 37 περίπου χρόνια, και Έλληνες Μικροβιολόγοι, όπως ο καθηγητής κ. Γ. Λεοναρδόπουλος, είχαν μετεκπαιδευθεί στο Εργαστήριό του στο Colindale. Β.Π-Π Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β’, Τόμος 15, Τεύχος 3, σελ. 142-147 2010 PANDAS: ΜΙΑ ΝΕΑ ΜΕΤΑΣΤΡΕΠΤΟΚΟΚΚΙΚΗ ΕΠΙΠΛΟΚΗ; Μ. ΔΑΣΚΑΛΑΚΗ, Μ. ΚΑΝΕΛΛΟΠΟΥΛΟΥ Νοσήματα που έχουν συσχετισθεί με λοιμώξεις από β- αιμολυτικό στρεπτόκοκκο ομάδας Α (S. pyogenes), είναι ο ρευματικός πυρετός, το οζώδες ερύθημα, η μεταστρεπτοκοκκική σπειραματονεφρίτιδα, η αντιδραστική αρθρίτιδα, καθώς και η δερματική πολυαρτηρίτιδα. Πρόσφατα στο φάσμα των ανωτέρω νοσημάτων προστέθηκε ομάδα ιδεοληπτικών-ψυχαναγκαστικών και άλλων ψυχιατρικών συμπτωμάτων καθώς και διαταραχών της κινητικότητας που παρατηρήθηκε σε παιδιά μετά από στρεπτοκοκκική λοίμωξη (GAS), όπου ο ρόλος της αυτοανοσίας είναι σημαντικός. Η πρόσφατη ομάδα ονομάζεται PANDAS (Pediatrtic Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with group A Streptococcal Infection) και παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον τόσο στη φυσιοπαθολογία, όσο και στη διάγνωση και αντιμετώπιση αυτών των ασθενών. (Λέξεις ευρετηρίου: PANDAS, GAS, β-αιμολυτικός στρεπτόκοκκος, ρευματικός πυρετός). Εισαγωγή Ο όρος PANDAS, ακρωνύμιο του Pediatric Autoinmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcal infections, χρησιμοποιείται για να περιγράψει μια ομάδα ιδεοληπτικών – ψυχαναγκαστικών διαταραχών και /ή γρήγορων επαναλαμβανόμενων μυϊκών συσπάσεων (tics) που εμφανίζονται κάθε φορά μετά από λοίμωξη από β- αιμολυτικό στρεπτόκοκκο ομάδας Α, (Streptococcus pyogenes), όπως φαρυγγίτιδα, αμυγδαλίτιδα, ή οστρακιά1,2. Ως ιδεοληπτικές χαρακτηρίζονται οι διαταραχές, όπου στη συνείδηση του ατόμου εισβάλλουν σκέψεις B΄ Μικροβιολογικό Τμήμα - Εργαστήριο Επειγόντων Περιστατικών «Σισμανόγλειο» Γενικό Νοσοκομείο Αττικής. ή εικόνες κατά τρόπο στερεότυπο, επαναλαμβανόμενο και ακούσιο, ενώ ως ψυχαναγκαστικές χαρακτηρίζονται επαναλαμβανόμενες συμπεριφορές ή νοητικά εκτελούμενες πράξεις προκειμένου να μειωθεί το άγχος των ιδεοληπτικών σκέψεων3,4. Τα παιδιά με διαταραχές PANDAS έχουν δραματικά απότομη έναρξη των συμπτωμάτων, τα οποία συνίστανται σε κινητικά ή ηχητικά tics, ιδεοληψίες και ψυχαναγκαστικές πράξεις, κακή διάθεση ή ευερεθιστότητα, ανησυχία, αδυναμία συγκέντρωσης στο σχολείο, αδυναμία μάθησης, αδυναμία ανάγνωσης, διαταραχές ύπνου, νυκτερινή ενούρηση, υπερκινητικότητα, άγχος αποχωρισμού από τους γονείς ή από άλλα αγαπημένα πρόσωπα4,5. Επίσης έχουν μη ελεγχόμενες μυϊκές συσπάσεις, όπως άνοιγμα-κλείσιμο των ματιών, ανύψωση των ώμων, Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 προκαλούν αυτόματους θορύβους, π.χ. βήχα για να καθαρίσει ο λαιμός, γρύλισμα ή κραυγές και πολύ συχνά επαναλαμβάνουν τις ίδιες λέξεις6. Πολλαπλές μυϊκές συσπάσεις παράλληλα με την παρουσία μιας τουλάχιστον ηχητικής μυϊκής σύσπασης παρατηρείται και στο σύνδρομο Tourette, στο οποίο γενετικοί, βιολογικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες προκαλούν δυσλειτουργία κυρίως των βασικών γαγγλίων του εγκεφάλου7. H χορεία του Sydenham η οποία αποτελεί κύριο κριτήριο Ρευματικού Πυρετού (ΡΠ), χαρακτηρίζεται από μυϊκή αδυναμία, μειωμένο έλεγχο της λεπτής κινητικότητας, δυσαρθρία και διαταραχές της συμπεριφοράς (συναισθηματική αστάθεια, άγχος, ιδεοψυχαναγκαστικά συμπτώματα κ.λπ.) αποδίδεται σε οξεία φλεγμονώδη αντίδραση κυρίως των βασικών γαγγλίων και λιγότερο του φλοιού του εγκεφάλου, γεγονός που επιβεβαιώνεται με απεικονιστικές τεχνικές8-11. Πιστεύεται ότι στην ομάδα διαταραχών PANDAS συμβαίνει κάτι ανάλογο με τη χορεία του Sydenham. Συγκεκριμένα προσβάλλονται τα βασικά γάγγλια του εγκεφάλου, τα οποία είναι υπεύθυνα για την κίνηση και τη συμπεριφορά. Πρωτεΐνες του κυτταρικού τοιχώματος του GAS ομοιάζουν με πρωτεΐνες των βασικών γαγγλίων, φαινόμενο το οποίο ονομάζεται μοριακή μίμηση (molecular mimicry)12,13. Καθιερώθηκαν πέντε διαγνωστικά κριτήρια μετά από την καταγραφή και ανάλυση των πληροφοριών 50 περιπτώσεων ασθενών με PANDAS1. Διαγνωστικά κριτήρια PANDAS1,14,15 1.Παρουσία ιδεοληπτικών/ψυχαναγκαστικών συμπεριφορών και / ή tics. Εμφανίζονται σε ποσοστό μέχρι 80% (και οι δύο τύποι) εντός έξι εβδομάδων από το επεισόδιο της στρεπτοκοκκικής λοίμωξης. 2.Ηλικία έναρξης των συμπτωμάτων, μεταξύ 3 ετών έως και πριν την εφηβεία. Προσβάλλονται και τα δύο φύλα, περισσότερο τα αγόρια (2,6:1 σε σχέση προς κορίτσια). 143 3.Απότομη έναρξη των συμπτωμάτων, ή δραματική επιδείνωση αυτών. Συνήθως οι ασθενείς θυμούνται ακριβώς την ημέρα και την ώρα που εμφανίστηκαν τα συμπτώματα. Η αποδρομή είναι βραδεία, διαρκεί εβδομάδες ή μήνες, μέχρι μία νέα στρεπτοκοκκική λοίμωξη να πυροδοτήσει νέο κύκλο συμπτωμάτων. 4.Παροδική επιδείνωση των συμπτωμάτων ως αποτέλεσμα λοίμωξης από τον β-αιμολυτικό στρεπτόκοκκο ομάδας Α. Αποδεικνύεται με θετική καλλιέργεια. 5.Συσχέτιση με νευρολογικές διαταραχές π.χ. υπερκινητικότητα, χορειόμορφες κινήσεις, οι οποίες είναι ακούσιες μικρές κινήσεις προσώπου και άνω άκρων, και tics κατά την υποτροπή. Φυσιοπαθολογία Είναι άγνωστες ακόμα πολλές πλευρές σχετικά με την παθογένεια του συνδρόμου PANDAS. Σύμφωνα με το μοντέλο που έχει προταθεί από την S.E. Swedo υπάρχει μια ιδιοσυστατική (γενετική) ευαισθησία των ατόμων που πάσχουν, ώστε μετά από επαφή με τον S. pyogenes λαμβάνει χώρα μια μη ομαλή ανοσιακή απάντηση με αποτέλεσμα την εμφάνιση της συγκεκριμένης νοσολογικής οντότητας1. Οι Pauls και οι συν. ανέλυσαν τη νοσηρότητα της διαταραχής Tourette και των ιδεοληπτικών-ψυχαναγκαστικών διαταραχών και θεώρησαν ότι πρόκειται για μια γενετική διαταραχή, που μεταβιβάζεται με τον επικρατούντα αυτοσωματικό χαρακτήρα και η οποία μπορεί να δικαιολογήσει την ευαισθησία αυτών των ατόμων με PANDAS16. Συγκεκριμένα το αντιγόνο επιφανείας 883 ή D8/17 των Β-λεμφοκυττάρων έχει βρεθεί επανειλημμένα σε ασθενείς με PANDAS (60.6-100% vs 1-5% ασθενών ομάδος ελέγχου ή ασθενών με άλλες ψυχιατρικές διαταραχές). Σημαντικά συχνότερη παρουσία του D8/17 ευρίσκεται σε κύτταρα παιδιών με ρευματικό πυρετό ή χορεία του Sydenham17,18. 144 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Σε πειραματικά μοντέλα με πειραματόζωα στα οποία έγινε έγχυση στον πλαγιοκοιλιακό βασικό πυρήνα του εγκεφάλου ορού ασθενών με διαταραχή Tourette α) με αυξημένα επίπεδα του αντιγόνου D8/17 (πρώτη ομάδα) β) ορού ασθενών με χαμηλά επίπεδα του ίδιου αντιγόνου (δεύτερη ομάδα) και γ) ορού φυσιολογικών ατόμων, (τρίτη ομάδα) διαπιστώθηκε ότι τα ποντίκια παρουσίαζαν ηχητικά tics σε μεγαλύτερη συχνότητα, όσο μεγαλύτερη ήταν η συγκέντρωση του αντιγόνου D8/17 στον ορό των ασθενών. Η διαφορά μεταξύ της πρώτης ομάδας και των δύο τελευταίων όπου τα επίπεδα του αντιγόνου D8/17 ήταν ελαττωμένα ή ανύπαρκτα, ήταν στατιστικά σημαντική. Έχει διαπιστωθεί ότι οι τιμές του είναι αυξημένες σε καταστάσεις που εντάσσονται στο πλαίσιο της κλινικής οντότητας PANDAS αλλά όχι σε άλλες μεταστρεπτοκοκκικές νόσους όπως στη μεταστρεπτοκοκκική σπειραματονεφρίτιδα και στο συστηματικό ερυθηματώδη λύκο. Η τιμή του παραπάνω αντιγόνου δεν μεταβάλλεται με την πάροδο του χρόνου, ούτε και μετά από επαναλοιμώξεις από τον β-αιμολυτικό στρεπτόκοκκο17-19. Το αντιγόνο D8/17 είναι μια ανοσοσφαιρίνη τύπου Μ, η οποία ανιχνεύεται με μονοκλωνικά αντισώματα, ανοσοφθορισμό ή κυτταρομετρία ροής. Η ευαισθησία και η ειδικότητα των δύο τελευταίων μεθόδων είναι παρόμοιες (70/87%,77/87%)19,20. Μελέτες όμως για τη χρησιμότητα του D8/17 ως διαγνωστικού δείκτη σε PANDAS, χορεία Sydenham και διάφορες νευροψυχιατρικές καταστάσεις είναι πρώιμες και σε εξέλιξη4,21. Λοίμωξη Ο μικροοργανισμός που έχει ενοχοποιηθεί περισσότερο για τη γένεση PANDAS είναι ο Streptococcus pyogenes ο οποίος διαθέτει πολλά αντιγονικά στοιχεία, όπως την πρωτεΐνη F, το λιποτειχοϊκό οξύ, τα υπεραντιγόνα και την πρωτεΐνη Μ, η οποία προκαλεί τη σημαντικότερη αντισωματική απάντηση. Ως γνωστόν η πρωτεΐνη Μ διαιρείται σε 85 οροτύπους. Σύμφωνα με πειραματικές μελέτες οι «ρευματογόνοι» ορότυποι: Μ6 (κυρίως), Μ5 και Μ19 (λιγότερο), καθώς και Μ24, παρουσιάζουν διασταυρούμενες αντιδράσεις με τον εγκεφαλικό ιστό. Στη διαταραχή Tourette διαπιστώθηκε ότι οι ορότυποι Μ12 και Μ19 παρουσίαζαν περισσότερες διασταυρούμενες αντιδράσεις με τον ιστό των βασικών γαγγλίων σε σχέση με άλλους οροτύπους22,23. Υποστηρίζεται ότι στους ασθενείς με PANDAS οι τίτλοι των αντισωμάτων έναντι της στρεπτολυσίνης,(ΑSΤO) και της DNAse B (antiDNAase B), είναι υψηλότεροι έναντι ομάδος ασθενών ελέγχου24,25. Αποτελέσματα αντίθετα με τα παραπάνω είχε η μελέτη των Murphy και συνεργατών, οι οποίοι διαπίστωσαν ότι ασθενείς με διαταραχή Tourette και με ιδεοψυχαναγκαστικές διαταραχές εμφάνιζαν διαφορές μόνο στο αντιγόνο D8/17. Μια εξήγηση για τη διαφορά αυτή μπορεί να είναι το γεγονός ότι στην περίπτωση της πρωτολοίμωξης μεσολαβεί ένα μεσοδιάστημα μεταξύ της ανόδου του τίτλου των αντισωμάτων και της πρώτης εκδήλωσης των συμπτωμάτων, το οποίο δεν υπάρχει στην περίπτωση των επαναλοιμώξεων, όπου η άνοδος του τίτλου των αντισωμάτων είναι άμεση19. Γι’ αυτόν το λόγο οι ίδιοι ερευνητές μελετώντας μία διαφορετική ομάδα ασθενών διαπίστωσαν ότι μεταξύ των ασθενών που παρουσίαζαν υποτροπές οι τίτλοι των ΑSΤΟ και antiDNAse B ήταν υψηλοί και έτσι κατά κάποιο τρόπο υποστηρίζεται η υπόθεση ότι η νόσηση από S. pyogenes δίνει γένεση σε ένα αυτοάνοσο μηχανισμό, ο οποίος με τη σειρά του προκαλεί τα συμπτώματα των διαταραχών, που εντάσσονται στο πλαίσιο της νοσολογικής οντότητας PANDAS19. Υποστηρίζεται ότι η ανοσολογική απάντηση στη λοίμωξη από GAS οδηγεί στο σχηματισμό αντισωμάτων έναντι του ιστού των βασικών γαγγλίων. Έχει διαπιστωθεί ότι ορισμένοι επίτοποι της πρωτεΐνης Μ είναι παρόμοιοι με αυτούς των ελικοειδών πρωτεϊνών, όπως π.χ. της μυοσίνης, της τροπονίνης και κερατίνης, καθώς και με τμήματα του κυτταροσκελετού του πυρήνα και της μεμβράνης των νευρώνων των Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 βασικών γαγγλίων22-28. Αυτό παράγει τον λεγόμενο μοριακό μιμιτισμό (molecular mimicry), με αποτέλεσμα να προκαλείται διασταυρούμενη αντίδραση και να παράγονται αυτοαντισώματα τύπου IgG, φλεγμονώδης αντίδραση τύπου ΙΙ και ανάλογα κλινικά συμπτώματα12,13. Δεν είναι γνωστό πώς γίνεται η διέλευση των αυτοαντισωμάτων δια μέσου του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Υποστηρίζεται ότι κατά τη διάρκεια μιας λοίμωξης η άνοδος της θερμοκρασίας προκαλεί αλλαγές στον αιματοεγκεφαλικό φραγμό, που είτε επιτρέπουν στα αυτοαντισώματα να τον διαπερνούν, είτε διευκολύνουν τη δημιουργία τους μέσα στο κεντρικό νευρικό σύστημα22-28. Πάντως αξίζει να αναφερθεί ότι έχουν περιγραφεί περιπτώσεις PANDAS, και μετά από λοιμώξεις που προκάλεσαν μικροοργανισμοί όπως: Borrelia burgdorferi και Mycoplasma pneumoniae. Έτσι μένει να διερευνηθεί, αν το PANDAS εμφανίζεται ως μεταλοιμώδης κατάσταση που προκαλείται από διάφορους μικροβιακούς παράγοντες και όχι μόνο τον πυογόνο στρεπτόκοκκο27. Θεραπεία Η θεραπεία του συνδρόμου προσανατολίζεται στα εξής: αρχικά σε κάθε παιδί με tics ή ιδεοψυχαναγκαστική συμπεριφορά πρέπει να γίνεται καλλιέργεια φαρυγγικού επιχρίσματος με τη λογική να αποδεικνύεται η συσχέτιση του νοσήματος με τον GAS. Υπάρχει συμφωνία χορήγησης πενικιλίνης ή αμοξυκιλίνης ή κεφαλοσπορίνης στις ενδεικνυόμενες δόσεις έστω και αν το παιδί δεν βρίσκεται στην οξεία φάση λοίμωξης, δεδομένου ότι το PANDAS είναι αυτοάνοσο νόσημα. Θεωρείται χρήσιμη η προφύλαξη με βενζαθενική πενικιλίνη G 1.200.000 U μια φορά το μήνα, ή η χορήγηση πενικιλίνης V 250 mg δυό φορές την ημέρα, ή αζιθρομυκίνης 500 mg μια φορά την εβδομάδα. Επίσης έχει δοκιμαστεί ενδοφλέβια χορήγηση ανοσοσφαιρίνης και πλασμαφαίρεσης, διαδικασίες όμως οι οποίες ενέχουν κινδύνους και επιπλοκές για τους ασθενείς4. Τέλος η συμβολή του παιδονευ- 145 ρολόγου-παιδοψυχιάτρου και του παιδορευματολόγου θεωρείται απαραίτητη και δεδομένη προκειμένου να χορηγηθεί η απαιτούμενη φαρμακευτική αγωγή σε ένα τόσο σύνθετο νόσημα όπως είναι το PANDAS. Διεύθυνση Επικοινωνίας: Μαρία Δασκαλάκη Βιοπαθολόγος, Επικουρικός Ιατρός Β΄ Μικροβιολογικού Τμήματος - ΤΕΠ Σισμανόγλειο Γενικό Νοσοκομείο Αττικής Τηλ.: 210 8039 807 Summary M. Daskalaki, M. Kanellopoulou PANDAS: (Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders) new post- streptococcal sequelae? 2nd Microbiology Department, Laboratory of Emergency Department «Sismanoglion» General Hospital of Athens Applied Clinical Microbiology Several diseases have been associated with preceding streptococcal disorders. In this group belong various inflammatory disorders like acute rheumatic fever, erythema nodosum, post-streptococcal glomerulonephritis, reactive arthritis and cutaneous polyarteritis. Recently to the spectrum of poststreptococcal diseases in children have been added several symptoms that range from obsessive-compulsive and neuropsychiatric disorders to motor tics and they have been considered to be a part of an autoimmune procedure. That recently described subgroup of childhood disorders have been named PANDAS, which is the acronyme of Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with group A Streptococcal Infection and is of great interest regarding its pathophysiology and patients’ management. To 146 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία make PANDAS diagnosis, patients must fulfill five criteria, including presence of obsessive-compulsive disorder and/ or a tic disorder, onset of symptoms between 3 years to puberty, episodic course of symptom severity, infection caused by S. pyogenes (positive throat culture) and neurological abnormalities. Penicillin G or V, or azithromycin and immunomodulatory treatment have been used and were considered useful in some patients. (Key words: PANDAS, S. pyogenes, rheumatic fever). Βιβλιογραφία 1.Swedo SE, Leonard HL, Garvey M, Mittleman B, Allen AJ, Perlmutter S, et al. Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcal Infections: Clinical Descripsion of the first 50 cases. Am J Psychiatrry 1998, 155(2): 264-271. 2.Kurlan R, Kaplan EL. The pediatric autoimmune psychiatric disorders associated with streptococcal infection (PANDAS) etiology for tics and obsessive-compulsive symptoms: hypothesis or entity? Practical considerations for the clinicians. Pediatrics 2004, 113: 883-886. 3.Towbin KE, Riddle MA. Obsessive-compulsive disorder. In: Lewis, edit; Child and Adolescent Psychiatry – A comprehensive Textbook. 3rd ed 2002, Lippincott, Williams & Wilkins. 4.Προκοπάκη Κ. Μικροβιακοί και ανοσολογικοί παράγοντες στην παθογένεση παιδιατρικών νευροψυχιατρικών διαταραχών. Δελτίο Α΄ Παιδιατρ Κλιν Πανεπ Αθηνών 2008, 55 (4): 341-357. 5.Cardona F, Orefici G. Group A Streptococcal infections and tic disorders in an Italian pediatric population. J Pediatr 2001, 138: 71-75. 6.Swedo SE. Pediatric autoimmune neuropsychiatric disorders associated with streptococcal infections (PANDAS). Mol Psychiatry 2002, 7 Suppl 2: S24-S25. 7.Trifiletti RR, Packard AM. Immune mechanisms in pediatric neuropsychiatric disorders. Tourette’ syndrome, ODC, and PANDAS. Child Adolesc Psychiatr Clin N Am 1999, 8: 767-775. 8.Hoekstra PJ, Kallenberg CG, Korf J, Minderaa RB. Is Tourette’s syndrome an autoimmune disease? Mol Psychiatry 2002, 7: 437-445. 9.Swedo SE, Rapoport JL, Cheslow DL, Leonard HL, Ayoub EM, Hosier DM, Wald ER. High prevalence of obsessive- compulsive symptoms in patients with Sydenham’s chorea. Am J Psychiatrtry 1989, 146: 246-249. 10.Castillo M, Kwock L, Arbelaez A. Sydenham’s chorea: MRI and proton spectroscopy. Neuroradiology 1999, 41: 943-945. 11.Giedd JN, Rapoport JL, Kruezi MJ, Parker C, Schapiro MB,Allen AJ et al. Sydenham’s chorea: magnetic resonance imaging of the basal ganglia. Neurology 1995, 45: 2199-2202. 12.Stocks M. Genetics of Childhood disorders: XXIX. Autoimmune disorders, part 2:Molecular mimicry. Am Acad Child Adolesc Psychiatry 2001, 40: 977-980. 13.Kirvan CA, Swedo SE, Henser JS. Mimicry and autoantibody-mediated neuronal cell signaling in Sydenham chorea. Nature Medicine 2003, 9: 914-920. 14.Swedo SE, Leonard HL, Rapoport JL. The Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcal Infection (PANDAS): Separating fact from fiction. Pediatrics 2004, 4: 907-911. 15.http://intramural.nimh.nih.gov/pdn/web.htm 16.Pauls DL, Towbin KE,Leckman JF, Zahner GE, Cohen DJ. Gilles de la Tourette’s syndrome and obsessive – compulsive disorder. Evidence supporting a genetic relationship. Arch Gen Psychiatry 1986, 43: 1180-1182. 17.Zabriskie JB, Lavenchy D, Williams RC. Reumatic fever – associated B cell alloantigens as identified by monoclonal antibodies. Arthritis Rheum 1985, 28: 1045-1051. 18.Hoekstra PJ, Bijzet J, Limburg PC, Steenhuis MP, Troost PW, Oesterhoff MD, et al. Elevated D8 / 17 expression on B lymphocytes, a marker of rheumatic fever, measured with flow cytometry in tic disorder patients. Am J Psychiatry 2001, 158: 605-610. 19.Murphy TK, Benson N, Zayton A, Yang M, Braylan R, Ayoub E, et al. Progress toward analysis of D8 / 17 bindiny to B cells in children with obsessive compulsive disorder and / or chronic tic disorder. J Neuroimmunol 2001, 120: 146151. 20.Chapman F, visvanathan K, Carreno - Manjarrez R, Zabriskie JB. A flow cytometric assay for D8 / 17 B cell marker in patients with Tourette’s Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 syndrome and obsessive compulsive disorder. J Immunol Methods 1998, 219: 181-186. 21.Hamilton CH, Garrey MA, Swedo S, Sokol MS. Sensitivity of the D8 / 17 assay. Am J Psychiatry 2003, 160: 1193-1194. 22.Cunningham MW. Pathogenesis of group A Streptococcal infections. Clin Microbiol Reviews 2000, 13: 470-511. 23.Muller N, Kroll B, Schwarz MJ, Riedel M, straubc A, Lutticken R, et al. Increased titers of antibodiesagainststreptococcalM12andM19proteins in patients with Tourette’s syndrom. Phychiatry Res 2001, 101: 187-193. 24.Peterson BS, Leckman JF, Tucker D, Scahill L, Staib L, zhang H, et al. Preliminary findings of antistreptococcal antibody titers and basal gaglia volumes in tic, obsessive – compulsive, and attention deficit / hyperactivity disorders. Arch Gen Psychiatry 2000, 57: 364-372. 25.Muller N, Riedel M, Straube A, Gunther W, Wilske B. Increased antistreptococcal antibodies with Tourette’s syndrome. Psychiatry Res 2000, 94: 43-49. 26.Leonard HL, Swedo SE. Paediatric autoimmune neuropsychiatric disorders associated with streptococcal infection (PANDAS). Int J Neuropsychopharmacol 2001, 4: 191-198. 27.Singer HS, Loiselle CR, Lee O, Minzer K. Swedo S, Grus FH. Antibasal ganglia antibodies in PANDAS. Mov Disord 2004, 19: 406-415. 28.Mercadante MT. Honnie AG, Diniz SB, Miguel EC, Lomboroso PS. The basal ganglia and immune - basal neuropsychiatric disorders. Psychiatr Ann 2001, 31: 534-540. Υποβλήθηκε: 31-3-2010 Εγκρίθηκε: 14-7-2010 ΣΩΣΤΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΙΣ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΤΟΥ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΟΥ ΤΕΥΧΟΥΣ Ερώτηση 1η: Γ. Ερώτηση 2η: Β. Ερώτηση 3η: Γ. Ερώτηση 4η: Δ. 147 Η αναζήτηση πυοσφαιρίων και ερυθρών στα κόπρανα Ο Rota ιός Με την ανοσοχρωματογραφία Η αναζήτηση αντισωμάτων στον ορό Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β’, Τόμος 15, Τεύχος 3, σελ. 148-158 2010 ΕΙΔΙΚΟ ΑΡΘΡΟ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΑΠΟ ACINETOBACTER spp ΜΥΡΤΩ ΚΑΤΡΑΜΑΔΟΥ Παρουσιάζονται νεότερα δεδομένα από το μεταπτυχιακό εκπαιδευτικό σεμινάριο της ESCMID το οποίο είχε θέμα «Λοιμώξεις από Acinetobacter spp: Μικροβιολογικές, κλινικές και θεραπευτικές απόψεις», το οποίο επικεντρώθηκε σε 5 θεματικές ενότητες: 1) βασικά μικροβιολογικά χαρακτηριστικά και εργαστηριακή διάγνωση, 2) επιδημιολογία και κλινικά χαρακτηριστικά, 3) αντοχή στα αντιβιοτικά, 4) διαχείριση των λοιμώξεων και τέλος 5) πρόληψη και έλεγχος των λοιμώξεων. Το σεμινάριο παρακολούθησε η συγγραφεύς από τις 3 έως 5 Σεπτεμβρίου του 2009 στην Κωνσταντινούπολη, με την οικονομική ενίσχυση της Εταιρείας Κλινικής Μικροβιολογίας και Εργαστηριακής Διαγνωστικής. Α΄ ΜΕΡΟΣ 1. Βασικά μικροβιολογικά χαρακτηριστικά και εργαστηριακή διάγνωση • Ταξινόμηση των ειδών του Acinetobacter (Harald Seifert, Γερμανία) • Βασικά μικροβιολογικά χαρακτηριστικά και εργαστηριακή ταυτοποίηση των Acinetobacter spp. (Deniz Gur, Τουρκία) • Παθογένεια και μολυσματικότητα (Marie-Laure Joly-Guillou, Γαλλία) 2. Επιδημιολογία και κλινικά χαρακτηριστικά • Μοριακή επιδημιολογία (Hilmar Wisplinghoff, Γερμανία) • Αύξηση της συχνότητας του Acinetobacter spp. ως νοσοκομειακού παθογόνου: επιδημιολογία και παράγοντες κινδύνου (Oral Oncul, Τουρκία) • Το φάσμα των κλινικών εκδηλώσεων της λοίμωξης από Acinetobacter spp. (Sesin Kocagoz, Τουρκία) Μικροβιολογικό Τμήμα Γ.Ν. «Γ. Γεννηματάς». Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 Ταξινόμηση Πίνακας 1. Τα 32 είδη του γένους Acinetobacter. Την έναρξη του σεμιναρίου έκανε ο Ha rald Seifert με τη διάλεξη: «Ταξινόμηση των ειδών του Acinetobacter». Τονίστηκε ότι το Acinetobacter αποτελεί το πρώτο από τα υψηλής επικινδυνότητας παθογόνα με βάση τη διαθεσιμότητα σε αντιμικροβιακά φάρμακα, σύμφωνα με την IDSA (Infectious Diseases Society of America). Ο κατάλογος αυτός περιλαμβάνει επίσης τον Aspergillus spp, τα εντεροβακτηριακά που παράγουν ευρέος φάσματος β-λακταμάσες (ESBL), τον βανκομυκίνη ανθεκτικό Enterococcus faecium (VRE), την Pseudomonas aeruginosa και τον μεθικιλλίνη ανθεκτικό Staphylococcus aureus (MRSA). Η πολυπλοκότητα του Acinetobacter προκύπτει από: 1) το μεγάλο αριθμό των ειδών, 2) την περίπλοκη ταξινόμηση των ειδών, 3) τις δυσκολίες στην εργαστηριακή ταυτοποίηση, τόσο σε επίπεδο ρουτίνας, όσο και για ερευνητικούς σκοπούς, 4) τη διαφορετική κλινική σημασία των ειδών, 5) τις διαφορές στην επιδημιολογία και κατανομή των επιδημικών εξάρσεων, 6) την διαφορετική αντοχή στα αντιμικροβιακά, 7) τις ποικίλες φυσικές δεξαμενές του μικροβίου που δεν έχουν ακόμα πλήρως διερευνηθεί. Ενώ το 1968 το γένος περιλάμβανε μόνο ένα είδος, το Acinetobacter calcoaceticus, σήμερα στο γένος υπάγονται 32 είδη, εκ των οποίων μόνο τα 21 έχουν ονομαστεί. Στον Πίνακα 1 αναγράφονται τα 32 είδη. Η πρώτη απομόνωσή του γένους Acineto bacter έγινε το 1911 (Beijerinck) από το χώμα σε εμπλουτισμένο θρεπτικό υλικό με άλατα οξικού ασβεστίου, από όπου προέκυψε και η ονομασία Micrococcus calcoaceticus. Το 1954 οι Brisou & Prevot περιγράφουν ένα Gram αρνητικό, ακίνητο αζυμωτικό κοκκοβακτηρίδιο, (ως Acinetobacter μεταφράζοντας την ελληνική λέξη «ακίνητος»). Μεγάλη σύγχυση επικράτησε στα χρόνια που ακολούθησαν, κατά τα οποία περιγράφονται πολλοί παρόμοιοι μικροοργανισμοί που ταξινομούνται σε διαφορετικά γένη και είδη και στους οποίους αποδίδονται δια- A. baumannii A. baylyi A. bereziniae A. beijerinckii, A. bouvetii, A. calcoaceticus, A. gerneri, A. guillouiae, A. gyllenbergii, A. haemolyticus, A. johnsonii, A. junii, A. lwoffii, A. parvus, A. radioresistens, A. schindleri, A. tjernbergiae, A. towneri, A. tandoii, A. ursingii A. venetianus 149 Τα λοιπά είδη παραμένουν χωρίς όνομα και αναφέρονται με αριθμούς: είδος 3 «μεταξύ 1 και 3» είδος 6 είδος 13 TU «κοντά στο 13 TU» είδος 13 BJ/14TU είδος 14 BJ είδος 15 TU είδος 15 BJ είδος 16 είδος 17 φορετικές ονομασίες. Το 1968 οι Baumann και συνεργάτες υποστήριξαν ότι όλοι αυτοί οι μικροοργανισμοί ανήκουν σε ένα και μόνο γένος, αυτό του Acinetobacter και ένα μόνο είδος, του Acinetobacter calcoaceticus, καθώς δεν υπήρχαν απόλυτα καθορισμένα φαινοτυπικά κριτήρια για την κατάταξη των ειδών του. Έτσι η τότε ταυτοποίηση του μικροβίου αυτού θα βασιστεί μόνο σε φαινοτυπικά χαρακτηριστικά και ιδιότητες, δηλαδή ενός Gram αρνητικού βακτηριδίου, οξειδάση αρνητικού, καταλάση θετικού, αυστηρά αεροβίου, ακίνητου και αζυμωτικού. Το βακτηρίδιο αυτό θα μπει τελικά το 1991 στην οικογένεια Moraxellaceae από τους Rossau και συνεργάτες και θα καταταχθεί φυλογενετικά στην γ-υποομοταξία των Propiobacteria. Η επανάσταση στην ταξινόμηση θα γίνει το 1969, όταν οι Juni & Janik ανακαλύπτουν ένα υπερμεταμορφούμενο στέλεχος του Acinetobacter calcoaceticus ικανό να προσλάβει τεμάχια DNA από αποδομημένα βακτηριακά κύτταρα και να τα ανασυνδυάσει στο δικό του χρωμόσωμα. 150 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Βασιζόμενος σε αυτή την παρατήρηση ο Juni το 1972 περιγράφει για πρώτη φορά 11 διαφορετικά είδη με στενή συγγένεια μεταξύ τους, που ανήκουν όλα στο γένος Acinetobacter. Σε μια ακόμα προσπάθεια ταξινόμησης οι Bouvet & Grimont (1986) χρησιμοποιούν τη μέθοδο του DNA- DNA υβριδισμού για να συμπεριλάβουν στο γένος Acinetobacter 6 είδη με όνομα και 6 ανώνυμα, σύνολο δηλαδή 12 είδη. Η ιστορική εξέλιξη της ταξινόμησης συνεχίστηκε μέχρι ο αριθμός των ειδών να φθάσει τα 32. Τα μέσα που χρησιμοποιούνται σήμερα για την ταξινόμηση συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Το A. calcoaceticus-A. baumannii complex περιλαμβάνει 6 γενοτυπικά διαφορετικά, αλλά φαινοτυπικά παρόμοια είδη (A. calcoaceticus, A. baumannii, groups: 3,13, μεταξύ 3 &13 και πλησιέστερα στο 13), από τα οποία μόνο τρία είδη είναι κλινικά σημαντικά. Για το λόγο αυτό προτάθηκε η ενσωμάτωση των τελευταίων σε μια ξεχωριστή ομάδα που θα ονομάζεται A. baumannii group. Χαρακτηριστικά και ταυτοποίηση Η επόμενη ομιλία έγινε από την Deniz Gur με θέμα: «Βασικά μικροβιολογικά χαρακτηριστικά και εργαστηριακή ταυτοποίηση των Acinetobacter spp». Αναφέρθηκε η ευρεία κατανομή τους στο φυσικό περιβάλλον όπου εντοπίζονται στο νερό, χώμα, φυτά, ζώα καθώς επίσης σε τρόφιμα φυτικά και ζωικά (π.χ. ωμό κρέας). Πίνακας 2. Μέθοδοι και τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την ταξινόμηση. 1) τεχνική μεταμόρφωσης του DNA 2) DNA- DNA υβριδισμός 3) φαινοτυπικές μέθοδοι 4) Protein SDS PAGE fingerprinting 5) AFLP (amplified fragment length polymorphism) fingerprinting 6) 16s rDNA sequence analysis 7) Amplified rDNA restriction analysis (ARDRA). Στον άνθρωπο αποικίζουν υγρά και ζεστά σημεία του σώματος, όπως τους βλεννογόνους του πεπτικού, ουροποιογεννητικού και αναπνευστικού (7% φάρυγγα), παροδικά ή μόνιμα. Η κυριότερη περιοχή μόνιμης αποικίσεως είναι το δέρμα (25%) όπου παραμένει ως μέλος της μόνιμης φυσιολογικής χλωρίδας και αποτελεί την κυριότερη πηγή μόλυνσης στον άνθρωπο. Στον χώρο του νοσοκομείου διαβιοί κυρίως σε περιοχές με υγρασία, όπως νεφελοποιητές, βρύσες, νεροχύτες και αναπνευστήρες, ενώ συχνά βρίσκεται στα χέρια γιατρών και νοσηλευτών, που γίνονται φορείς, μεταφέρουν και διασπείρουν το επιδημικό στέλεχος κατά τη διάρκεια νοσοκομειακών επιδημιών. Τα πιο συχνά είδη που συναντώνται στην κλινική πράξη είναι το A. baumannii (μέχρι προσφάτως γνωστό ως A. calcoaceticus var anitratus) και το A. lwoffii (ομοίως γνωστό ως A. calcoaceticus var lwoffii) τα οποία είναι Gram αρνητικά βακτήρια, κοντά και παχιά στη φάση του πολλαπλασιασμού και διαιρέσεως, και κόκκοι στη φάση της στασιμότητας, μεγέθους από 1,0-1,5 μέχρι 1,5-2,5 μm. Διατάσσονται κατά ζεύγη ή κοντές αλυσίδες και στη Gram χρώση άμεσου παρασκευάσματος από φιάλες αιμοκαλλιεργειών μπορεί να έχουν την παραπλανητική μορφή των Gram (+) κόκκων. Αρκετά στελέχη τους φέρουν έλυτρο και όλα τα είδη είναι αυστηρά αερόβια. Δεν αναπτύσσονται σε αναερόβιες ή μικροαερόφιλες συνθήκες. Όλα τα είδη είναι οξειδάση αρνητικά, καταλάση θετικά και δεν ανάγουν τα νιτρικά. Αναπτύσσονται στα συνήθη θρεπτικά υλικά του εργαστηρίου σε pH 5,5-6 και σε θερμοκρασία 30-32οC. Στο αιματούχο άγαρ οι αποικίες του A. baumannii είναι μεγάλες 1,5-3 mm, άχρωμες, λείες και βλεννώδεις. Ενώ στο MacConkey άγαρ μπορεί να μιμηθεί ένα βακτήριο που ζυμώνει τη λακτόζη καθώς είναι σακχαρολυτικό και παράγει οξέα από τη διάσπαση της γλυκόζης, ξυλόζης και λακτόζης ενώ δεν διασπά τη μαλτόζη. Σε αντίθεση με τα άλλα είδη το A. baumannii αναπτύσσεται και στους 42οC και δεν εμφανίζει ποτέ αιμόλυση στο αιματούχο Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 άγαρ. Τα άλλα είδη εμφανίζουν μικρότερες σε μέγεθος αποικίες και αρκετά από αυτά είναι αιμολυτικά, π.χ. το A. haemolyticus και τα είδη 6,13BJ, 14BJ, 15BJ, 16 και 17. Επίσης αναφέρθηκε ότι οι διαθέσιμες διαγνωστικές μέθοδοι, όπως ο DNA-DNA υβριδισμός αποτελεί πάντα τη μέθοδο αναφοράς, αλλά δεν είναι κατάλληλος για εφαρμογή στην καθημερινή πράξη, καθώς επίσης και η φαινοτυπική κατάταξη κατά Bouvet & Grimont είναι ακατάλληλη για καθημερινή χρήση στο εργαστήριο. Στις μοριακές μεθόδους που χρησιμοποιούνται σήμερα για την ταυτοποίηση απομονωθέντων μετά από καλλιέργεια Acinetobacter spp. προστίθενται ως πιο πρόσφατες: 1) ταυτοποίηση του Α. baumannii μέσω ανίχνευσης του blaOXA-51 γονιδίου με PCR, 2) PCR-ESI-MS (PCR/electrospray ionization mass spectrometry) και 3) PCR που αναγνωρίζει τις διαφορές στο gyrB γονίδιο μεταξύ του Α. baumannii και των άλλων ειδών (Higgins και συν.). Τα στελέχη που διαχωρίζονται αυξάνουν τις γνώσεις μας στην επιδημιολογία και συμβάλλουν στην κατανόηση της κλινικής σημαντικότητας των λοιμώξεων, αλλά η χρήση των μεθόδων αυτών περιορίζεται σε εργαστήρια αναφοράς, επειδή είναι εξαιρετικά χρονοβόρες και υψηλού κόστους για τα μικροβιολογικά εργαστήρια των νοσοκομείων. Τελικά η ταυτοποίηση των ειδών επιχειρείται με αυτοματοποιημένα και ημι-αυτοματοποιημένα συστήματα τύπου API 20NE, Vitek 2, Phoenix και MicroScan Walk Away, όμως η μεγαλύτερη δυσκολία παραμένει η υπάρχουσα περιορισμένη βάση δεδομένων, καθώς τα Α. baumannii, και τα είδη 3 και 13TU, σύμφωνα με αυτήν αναγνωρίζονται λανθασμένα σαν Α. baumannii. Υπογραμμίστηκε η ανάγκη για την πλήρη ταυτοποίηση των ειδών, διότι έχει μεγάλη κλινική σημασία να διαφοροποιείται το Α. baumannii από τα άλλα Acinetobacter, αφού τα τελευταία είναι συνήθως πιο ευαίσθητα στα αντιβιοτικά, οι λοιμώξεις που προκαλούν είναι πιο καλοήθεις και τα μέτρα ελέγχου των λοιμώξεων που πρέπει να λαμβάνονται είναι διαφορετικά. 151 Εξαιρετικό ενδιαφέρον είχε η αναφορά στο CHROMagar Acinetobacter (Paris, France) (CA-Acin), που αποτελεί ένα νέο χρωμογόνο εκλεκτικό άγαρ για την ταχεία ταυτοποίηση του πολυανθεκτικού Α. baumannii. Στο υλικό αυτό μετά από 18-24 ώρες επώασης οι αποικίες του έχουν χρώμα σκούρο πράσινο-μπλε. Συγκεκριμένα, αναφέρθηκαν δύο μελέτες: 1) των Gilligan και συν. (American Society for Microbiology 2009) που διερεύνησαν τη χρησιμότητα του CA-Acin συγκριτικά με εκείνη των BHI ζωμών με προσθήκη16 mg/ml ιμιπενέμης, για την ανίχνευση πολυανθεκτικού Acinetobacter (MDRAcinetobacter). Οι ανωτέρω ερευνητές έλαβαν μεταξύ Ιουλίου-Νοεμβρίου 2008, 258 δείγματα από επιφάνειες δέρματος και 258 δείγματα αναπνευστικού από νοσοκομειακούς ασθενείς, τα οποία ενοφθαλμίστηκαν τόσο στο CA-Acin, όσο και στους BHI ζωμούς. Παρατηρήθηκε πως η P. aeruginosa και η S. maltophilia επίσης δίνουν ιδίου χρώματος αποικίες με το Α. baumannii στο CA-Acin που όμως διαφοροποιούνται με βάση την αντίδραση οξειδάσης και τη μορφολογία των αποικιών. Η μέθοδος είχε ευαισθησία 96,8% και ειδικότητα 88,9%. Συμπεραίνεται ότι το CA-Acin είναι ένα αποτελεσματικό μέσο στην ανίχνευση των MDRAcin, όμως για τις MDR και nonMDR P. aeruginosa και S. maltophilia, τα εργαστήρια θα πρέπει να διενεργούν επιπλέον διαγνωστικές δοκιμασίες (για να επιβεβαιώσουν ή να αποκλείσουν την παρουσία των MDRAcin). 2) μελέτη των N.C. Gordon & D.W. Ware ham (J. Clin. Microb. 2009 Jul; 47[7]: 2249-51) στην οποία το CA-Acin χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση φορείας πολυανθεκτικού Α. baumannii σε κόπρανα και ορθικούς στυλεούς που ελήφθησαν από βαρέως πάσχοντες και έδειξε ευαισθησία 91,7% και ειδικότητα 89,6%. Η σύγκριση των αποτελεσμάτων έγινε με εκείνα της PCR. Βασικό μειονέκτημα που παρουσίαζε και εδώ το CA-Acin ήταν η ανάπτυξη και άλλων αζυμωτικών αλλά και ζυμούντων βακτηρίων, όπως π.χ. των K. pneumoniae, E. coli, S. maltophilia, C. meningosepticum. 152 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Σύμφωνα με το CLSI 2009, τα αντιβιοτικά με τα οποία οφείλουν τα εργαστήρια να ελέγχουν την ευαισθησία των Acinetobacter spp. χωρίζονται σε 3 κατηγορίες (Πίνακας 3): Ομάδα A) Ampicillin-Sulbactam, Ceftazidime, Ciprofloxacin, Levofloxacin, Imipenem, Mero penem, Gentamicin, Tobramycin, Amikacin, Piperacillin-tazobactam, Ticarcillin-clavulanate, Cefepime, Cefotaxime, Ceftriaxone (που ανήκουν στο βασικό έλεγχο και πρέπει να αναφέρονται στο αντιβιόγραμμα), Ομάδα B) A mikacin, Piperacillin-tazobactam, Ticarcillinclavulanate, Cefepime, Cefotaxime, Ceftriaxone, Doxycycline, Minocycline,Tetracycline, Pipe racillin, Trimethoprim-sulfamethoxazole (που ανήκουν στο βασικό έλεγχο, αλλά αναφέρονται επιλεκτικά στο αντιβιόγραμμα) και Ομάδα Γ) Colistin, Polymyxin B (που είναι συμπληρωματικά, αναφέρονται επιλεκτικά και μόνο με προσδιορισμό τιμής MIC). Προβλήματα υπάρχουν σχετικά με την τιγεκυκλίνη, για την οποία δεν έχουν καθοριστεί από το CLSI οι κριτικές συγκεντρώσεις (break points). Χρήσιμες πληροφορίες για την καθημερινή πρακτική ήταν οι εξής: όταν υπάρχει δυσκολία στην ταυτοποίηση, ένα πολυανθεκτικό στέλεχος είναι συνήθως baumannii, ενώ ένα πολυευαίσθητο non baumannii που μπορεί και να αγνοηθεί. Τα εργαστήρια στη Γαλλία χρησιμοποιούν κλιβάνους με διαφορετικές θερμοκρασίες για να διαφοροποιούνται τα είδη από την ανάπτυξή τους. Στην Αγγλία γίνεται χρήση κατά 80% μη αυτοματοποιημένων συστημάτων, ενώ στην Τουρκία κατά 99% των αυτοματοποιημένων. Παθογένεια και λοιμογόνος δύναμη Η καθηγήτρια Marie Laure Joly Guillou παρουσίασε το θέμα: «Παθογένεια και λοιμογόνος δύναμη», με στατιστικά δεδομένα που εμφανίζουν το Α. baumannii ως 8ο αίτιο νο- Πίνακας 3. Αντιβιοτικά προτεινόμενα από το CLSI 2009 για το βασικό εργαστηριακό έλεγχο των Acinetobacter spp. ΟΜΑΔΑ Α • ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΑΝΑΦΕΡΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑ Ampicillin-sulbactam Ceftazidime Ciprofloxacin Gentamicin Tobramycin Amikacin Piperacillin-tazobactam ΟΜΑΔΑ B • ΑΝΗΚΟΥΝ ΣΤΟΝ ΒΑΣΙΚΟ ΕΛΕΓΧΟ ΑΛΛΑ ΑΝΑΦΕΡΟΝΤΑΙ ΕΠΙΛΕΚΤΙΚΑ ΣΤΟ ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑ Amikacin Piperacillin-tazobactam Ticarcillin-clavulanate Minocycline Cefepime Tetracycline Cefotaxime Piperacillin Ceftriaxone TrimethoprimDoxycyclinesulfamethoxazole ΟΜΑΔΑ Γ • ΕΙΝΑΙ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΑ • ΜΟΝΟ ΜΕ ΤΙΜΕΣ MICs ΑΝΑΦΕΡΟΝΤΑΙ ΕΠΙΛΕΚΤΙΚΑ ΣΤΟ ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑ Colistin Polymyxin B • Η ΜΕΘΟΔΟΣ ΔΙΑΧΥΣΗΣ ΔΙΣΚΙΩΝ ΕΙΝΑΙ ΑΚΑΤΑΛΛΗΛΗ Levofloxacin Imipenem Meropenem Ticarcillin-clavulanate Cefepime Cefotaxime Ceftriaxone Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 σοκομειακής λοίμωξης στην Ευρώπη και 2ο αίτιο στις ΗΠΑ, ενώ το ποσοστό θνητότητας από λοίμωξη αναπνευστικού (πνευμονία στις ΜΕΘ) κυμαίνεται μεταξύ 30-50%. Τονίστηκε ιδιαιτέρως πως το Α. baumannii μπορεί και να αποτελεί μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας και να προκαλέσει νόσο σε υγιείς, αν διεισδύσει βαθύτερα στους ιστούς μέσω τραύματος, εγχειρήσεως ή καθετήρων, ενώ τα non baumannii είδη προσβάλλουν περισσότερο τους ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς. Ως παράγοντες κινδύνου αναφέρθηκαν η υποκείμενη νόσος, η παρατεταμένη νοσηλεία και η προηγούμενη χορήγηση αντιβιοτικής αγωγής. Στις ΜΕΘ παρατηρείται πολυαντοχή και η μετάδοση γίνεται με επαφή μέσω χεριών του προσωπικού ή μέσω αντικειμένων του νοσοκομειακού περιβάλλοντος. Συνοπτικά αναφέρονται οι παράγοντες λοιμογόνου δύναμης του βακτηρίου, στον Πίνακα 4. Επισημάνθηκε ότι το Α. baumannii αποτελεί σημαντικό νοσοκομειακό παθογόνο σε βαρέως πάσχοντες, με εξασθενημένο ανοσοποιητικό σύστημα, προκαλώντας κυρίως λοιμώξεις (σε ασθενείς με ουροκαθετήρα, μικροβιαμία σε ασθενείς με φλεβικούς και αρτηριακούς καθετήρες και μηνιγγίτιδα σε ασθενείς με βαλβίδα), οι οποίες οφείλονταν σε στελέχη που παρήγαγαν άνω του 60% βιομεμβράνη. Επίσης ότι με τη μορφή αυτή προσκολλάται στα επιθηλιακά κύτταρα των βρόγχων και κυψελίδων, προκαλώντας λοίμωξη αναπνευστικού. Σε πειραματικά μοντέλα επιμύων με πνευμονία, το ποσοστό επιβίωσης ήταν σημαντικά χαμηλότερο στις λοιμώξεις από στελέχη που παράγουν βιομεμβράνη. Όσον αφορά στην ερώτηση αν πρέπει να φοβόμαστε το Α. baumannii, η ομιλήτρια παρουσιάζοντας δύο βαρύτατες περιπτώσεις νεκρωτικής μυϊκής περιτονίας (fasciitis) έκλεισε την ομιλία της λέγοντας πως η λοιμογόνος δύναμη του Α. baumannii οφείλεται σε χιλιάδες παράγοντες, η δε απόκτηση εξωγενούς γενετικού υλικού που έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη μηχανισμών αντοχής του μικροβίου στα αντιβιοτικά, είναι 153 Πίνακας 4. Παράγοντες λοιμογόνου δύναμης του A. baumannii. 1) υδροφοβικότητα του βακτηριακού τοιχώματος 2) ινίδια (fibriae/pili), – μακριά και ακανόνιστα με σημαντικό ρόλο στον σχηματισμό βιομεμβράνης (biofilm) – κοντά και λεπτά με ενεργό ρόλο στην προσκόλληση σε ιστούς και επιφάνειες 3) πρωτεΐνες εξωτερικής μεμβράνης 4) λιποπολυσακχαρίτες 5) δημιουργία ελύτρου και παραγωγή βιομεμβράνης, 6) δέσμευση σιδήρου από ποικίλες πηγές και με διαφορετικού τύπου σιδηροφόρα, 7) παραγωγή ενζύμων όπως εστεράσης, φωσφολιπάσης, πρωτεάσης, λευκοκτονίνης κ.λπ. 8) γονιδίωμα που μπορεί να προσλαμβάνει ελεύθερο DNA από το εξωτερικό περιβάλλον, ιδιότητα που το καθιστά ακόμα πιο λοιμογόνο. στοιχείο που οφείλει να μας κάνει προσεκτικούς και να μας θέτει σε επιφυλακή. Επιδημιολογία και κλινικά χαρακτηριστικά Την επόμενη διάλεξη έδωσε ο Hilmar Wisplinghoff, με θέμα: «Μοριακή Επιδημιολογία». Παρουσίασε όλες τις φαινοτυπικές και γενοτυπικές μεθόδους που σήμερα χρησιμοποιούνται στην επιδημιολογική μελέτη των Acinetobacter spp. αναλύοντας την κάθε μια ξεχωριστά και επισημαίνοντας τα πλεονεκτήματα και μειονεκτήματά τους. Το θέμα της παρουσίασής του σε πολλά σημεία είχε καλυφθεί από τους προηγούμενους ομιλητές, αλλά ξεχώρισε τις παρακάτω μεθόδους: 1) PFGE (pulse field gel electrophoresis) που αποτελεί τον «χρυσό κανόνα» για τη διάγνωση του Α. baumannii, με την υψηλότερη διακριτική ικανότητα, αλλά απαιτεί εντατική εργασία και υπάρχει δυσκολία στην επίτευξη επαναληψιμότητας μεταξύ των εργαστηρίων κυρίως λόγω ελλείψεως προτυποποιημένων πρωτοκόλλων. 2) RAPD-PCR: είναι γρήγορη, εύκολη και χαμηλού κόστους και έχει επαρκή διακριτική ικανότητα για ανάλυση επι- 154 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία δημίας, αλλά υπάρχει δυσκολία στην επίτευξη επαναληψιμότητας, τόσο ενδοεργαστηριακά, όσο και μεταξύ διαφόρων εργαστηρίων. Δεν είναι κατάλληλη για ευρείας κλίμακας επιδημιολογικές μελέτες, με διακριτική ικανότητα κατώτερη της PFGE. 3) AFLP: είναι μέθοδος με υψηλή διακριτική ικανότητα, αλλά απαιτεί υψηλό επίπεδο προτυποποιήσεως και μεγάλη εμπειρία· κουραστική και πολυδάπανη, περιοριζόμενη σε εργαστήρια αναφοράς. Δεν είναι κατάλληλη για επιδημιολογικές αναλύσεις ρουτίνας. 4) MLST: είναι εξαιρετικά αναπαραγώγιμη, χρονοβόρος, πολυδάπανη, με υψηλή διακριτική ικανότητα και μεγάλη συσχέτιση με PFGE και AFLP. 5) PCR/ESI-MS: είναι εύκολη, ταχύτατη, νεότερη μέθοδος, αλλά απαιτεί ακριβό εξοπλισμό, μη κατάλληλη για διαγνωστικό εργαστήριο. Συμπερασματικά είπε πως οι νεότερες μέθοδοι MLST και PCR/ESI-MS είναι πολλά υποσχόμενες για την έρευνα της πληθυσμιακής δομής του Α. baumannii και των άλλων Acinetobacter spp. Στη συνέχεια συζητήθηκε το φαινόμενο της παραμονής των κλώνων του Α. baumannii (>11 χρόνια παραμονή ενός κλώνου σε ΜΕΘ στο Νότιγχαμ και εναλλασσόμενη παραμονή 5 κλώνων σε αρκετές ΜΕΘ τριτοβάθμιου ιατρικού κέντρου στην Κολωνία). Ως κοινή πηγή επιδημιών αναγνωρίστηκε ο ιατρικός εξοπλισμός και συγκεκριμένα: αναπνευστήρες, νεφελοποιητές, κλίνες ασθενών, στρώματα, μαξιλάρια, περιχειρίδες, ενδοφλέβιες εγχύσεις, σκόνη σε διάφορες ιατρικές συσκευές, πληκτρολόγια, υπολογιστές, και κινητά τηλέφωνα. Πιθανοί τρόποι μεταδόσεως θεωρούνται η επαφή μεταξύ ασθενών, η μεταξύ ιατρονοσηλευτικού προσωπικού και ασθενών και πιθανόν η αερογενής μετάδοση. Οι αποικισμένοι νοσοκομειακοί ασθενείς αποτελούν την πρωταρχική δεξαμενή του Α. baumannii. Παράγοντες κινδύνου για τη μετάδοση αποτελούν η μακρά νοσηλεία, η αντιμικροβιακή αγωγή, ο μηχανικός αερισμός, η μόλυνση του περιβάλλοντος χώρου, η έλλειψη ιατρονοσηλευτικού προσωπικού σε σχέση με τον αυξημένο αριθμό ασθενών, η ανεπαρκής εφαρ- μογή των κανόνων υγιεινής και τέλος η επαφή με αποικισμένους ασθενείς με Α. baumannii. Στο σημείο αυτό ο ομιλητής αναφέρθηκε σε μια σειρά επιδημιολογικών μελετών που έχουν διεξαχθεί στις ΗΠΑ και σε αρκετές ευρωπαϊκές πόλεις και διερευνούσαν τους υπεύθυνους για τις επιδημίες κλώνους του Α. baumannii. Προέκυψε ότι οι ευρωπαϊκοί κλώνοι Ι, ΙΙ και ΙΙΙ που απομονώθηκαν σε Βέλγιο, Δανία, Τσεχία, Γαλλία, Ισπανία, Ολλανδία, Αγγλία, Ιταλία, Ελλάδα, Τουρκία και ταυτοποιήθηκαν με ριβοτυπία και PFGE, δεν σχετίζονταν μεταξύ τους επιδημιολογικά και δεν ευθύνονταν για το μεγαλύτερο ποσοστό επιδημιών. Επίσης σε μελέτη που αφορούσε στα 189 στελέχη που απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν με PCR/ESIMS, από στρατιώτες που είχαν λάβει μέρος σε στρατεύματα του Ιράκ, όταν τα συνέκριναν με τους ευρωπαϊκούς κλώνους Ι, ΙΙ και ΙΙΙ, πάλι δεν επιβεβαιώθηκε επιδημιολογική συσχέτιση. Συμπεραίνεται ότι υπάρχουν 8 παγκόσμιοι κλώνοι πανανθεκτικού Α. baumannii που προκαλούν ανεξάρτητες επιδημίες, αφορούν σε στελέχη της κοινότητας, συγκριτικά με τις επιδημίες που προκαλούνται από στελέχη MRSA και οφείλονται σε ένα μονάχα κλώνο. Τονίστηκε πως η μετάδοση ξεκινάει πάντα από μια κοινή πηγή και συνεχίζεται από ασθενή σε ασθενή. Έπειτα η επιδημία επεκτείνεται σε πολλά νοσοκομεία της ίδιας πόλης, μετά σε πολλές πόλεις εντός μιας χώρας και τέλος σε νοσοκομεία διαφορετικών χωρών. Έτσι ο έλεγχος μετάδοσης της λοίμωξης αποδεικνύεται πολύ δύσκολος. Acinetobacter spp. ως νοσοκομειακό παθογόνο Ο Oral Oncul μίλησε για συχνότητα και επιδημιολογία. Παρουσίασε μελέτη που διενεργήθηκε τη δεκαετία 1987-1996 στην Ατλάντα της Γεωργίας-ΗΠΑ με τη συνεργασία του Εθνικού Συστήματος Επιτήρησης Νοσοκομειακών Λοιμώξεων και πραγματεύεται την εποχική κατανομή των λοιμώξεων από Acinetobacter spp. Συγκεκριμένα μεταξύ των μηνών ΙουλίουΟκτωβρίου καταγράφηκε αύξηση των λοιμώ- Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 ξεων σε σχέση με τους μήνες Νοέμβριο-Ιούνιο, η οποία αποδόθηκε στις υψηλότερες θερμοκρασίες και στην υγρασία της εποχής. Σε άλλη μελέτη που έλαβε χώρα το 2007 στο Ισραήλ αναφέρεται πως ο παρατεταμένος αποικισμός των ασθενών είναι δυνατόν να συμβάλει στην ενδημικότητα των Acinetobacter spp. Τονίστηκε ότι η αντοχή διακρίνεται σε δύο κατηγορίες: 1) στην αντοχή σε 3 ή περισσότερες κατηγορίες αντιμικροβιακών, όπως κινολόνες, κεφαλοσπορίνες, καρβαπενέμες και 2) στην αντοχή σε όλα τα αντιμικροβιακά, εκτός από την κολιστίνη. Είναι εντυπωσιακό το γεγονός ότι τα Acine tobacter spp. βακτήρια που εμπλέκονται σε νοσοκομειακές λοιμώξεις τα τελευταία 30 χρόνια, προσφάτως εμφανίστηκαν κατά τη διάρκεια πολέμων και φυσικών καταστροφών. Στο τσουνάμι της Νοτιοανατολικής Ασίας το 2004, 17 ασθενείς βαριά τραυματισμένοι εμφάνισαν 20% MDR Acinetobacter spp. Επίσης ένας ασθενής με εγκαύματα, τραυματισμένος στην τρομοκρατική βομβιστική επίθεση στο Μπαλί το 2002, που μεταφέρθηκε σε ΜΕΘ στην Ελβετία, ήταν η πηγή της επιδημίας που ξέσπασε έπειτα στη ΜΕΘ από MDR Acinetobacter spp. Τέλος μελέτη που διενεργήθηκε στην Κωνσταντινούπολη, ανέδειξε το Α. baumannii ως επικρατούν αίτιο λοίμωξης σε ασθενείς της ΜΕΘ που νοσηλεύτηκαν μετά το σεισμό του Μαρμαρά το 1999. Αναφέρθηκε επίσης στην ολοένα αυξανόμενη συχνότητα νοσοκομειακών επιδημιών που παρατηρείται στην Ευρώπη μετά το 1980 και στη διασπορά των MDR στελεχών σε εθνική κλίμακα και συγκεκριμένα των: νοτιοανατολικού κλώνου και των κλώνων Oxa-23 1-2 στην Νοτιοανατολική Αγγλία, MDR A. baumannii κλώνου στην Πορτογαλία, VEB-1 ESBL A. baumannii κλώνου στην Βόρεια και Νοτιοανατολική Γαλλία και ανθεκτικού στην αμικασίνη A. baumannii κλώνου στην Ισπανία. Σημειώθηκε η επιδημική διασπορά του MDR A. baumannii μέσω της παγκοσμίου μεταφοράς αποικισμένων ασθενών όπως έγινε από την Νότια στη Βόρεια Ευρώπη. Ειδικότερα εντο- 155 πίστηκαν οι ευρωπαϊκοί κλώνοι: Ι στην Βόρεια Ευρώπη (Βέλγιο, Δανία, Τσεχία, Γαλλία, Ισπανία, Ολλανδία, Αγγλία), ΙΙ στην Νότια Ευρώπη (Ιταλία, Ισπανία, Ελλάδα, Τουρκία) και ΙΙΙ στην Ανατολική Ευρώπη. Υψηλότερη αντοχή στις καρβαπενέμες του A. baumannii εμφανίζεται στην Τουρκία, Ελλάδα, Ιταλία, Ισπανία και Αγγλία, χαμηλή αντοχή στη Γερμανία και Ολλανδία, χαμηλότατη στις σκανδιναβικές χώρες, ενώ αυξανόμενος είναι ο ρυθμός αντοχής στην Ανατολική Ευρώπη. Παρατηρήθηκε αύξηση της αντοχής στη μεροπενέμη κατά τη διάρκεια των ετών 20022004 σύμφωνα με αναφορά της MYSTIC (Meropenem Yearly Susceptibility Test In formation Collection) καθώς και του CDC για την αύξηση της αντοχής στις καρβαπενέμες μεταξύ των ετών 1995-2004. Αξιοσημείωτη είναι ακόμα η παρατήρηση της αύξησης των λοιμώξεων από Acinetobacter spp. στους στρατιώτες των πολέμων στη Μέση Ανατολή, με 37% των στελεχών ανθεκτικών στην ιμιπενέμη, με 8 μg/ ml MIC90 για την τιγεκυκλίνη και με παραγωγή καρβαπενεμασών από τα στελέχη OXA-23 και OXA-58. Ο αποικισμός του σώματος των στρατιωτών προΰπήρχε του τραυματισμού, λόγω της επαφής τους με το έδαφος και η ανάπτυξη αντοχής πιθανολογείται ότι οφειλόταν στη χρήση αντιμικροβιακών στα νοσοκομεία των πεδίων των μαχών, τα δε στελέχη που απομονώθηκαν από τους στρατιώτες των ΗΠΑ και Αγγλίας ήταν παρόμοια. Υψηλή αντοχή επίσης παρατηρείται στη Λατινική Αμερική. Σε ό,τι αφορά στην αφρικανική ήπειρο υπάρχουν λίγα αξιόπιστα δεδομένα μόνο για τη Νότιο Αφρική. Στην Ασία και Μέση Ανατολή περιγράφονται επιδημίες από πανανθεκτικό (PDR) A. baumannii με παραγωγή ποικιλίας καρβαπενεμασών, ενώ στη Δυτική Αυστραλία παρατηρήθηκε η πρώτη επιδημία και ακολούθησαν άλλες στις ανατολικές παράκτιες περιοχές. Υπάρχει ευρεία διαμάχη στη βιβλιογραφία για την κλινική σημασία της λοίμωξης από A. baumannii, καθώς καταγράφεται αύξηση της νοσηρότητας, παράταση νοσηλείας στο νοσο- 156 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία κομείο και στις ΜΕΘ, που δεν ακολουθείται όμως από αύξηση της θνητότητας. Ωστόσο οι λοιμώξεις από Acinetobacter spp και MDR A. baumannii θεωρούνται πιο επικίνδυνες από εκείνες άλλων Gram (-) μικροβίων και της MDR P. aeruginosa. Ακατάλληλη εμπειρική αγωγή, κακοήθη αιματολογικά νοσήματα, βακτηριαιμία αγνώστου αιτιολογίας, σηπτικό shock, αντοχή στις καρβαπενέμες και σακχαρώδης διαβήτης, αποτελούν τους παράγοντες κινδύνου θνητότητας. Συμπερασματικά λόγω της αύξησης των MDR Acinetobacter spp καθίσταται επιτακτική η ανάγκη για ενεργό επιτήρηση και αιτιολογημένη χρήση των αντιβιοτικών, ώστε να επιτευχθεί αποτελεσματικότερος έλεγχος των λοιμώξεων. Κλινικές εκδηλώσεις Ο καθηγητής Sesin Kocagoz ανέπτυξε το «Φάσμα των κλινικών εκδηλώσεων των λοιμώξεων από Acinetobacter spp». Τα Acinetobacter spp μέχρι το 1960 συχνά αγνοούνταν ακόμα και αν απομονώνονταν από κλινικά δείγματα, καθώς θεωρούνταν παθογόνα χαμηλής λοιμογόνου δύναμης. Οι περισσότερες δε νοσοκομειακές λοιμώξεις πριν το 1970 αφορούσαν λοιμώξεις ουροποιητικού σε ασθενείς της ΜΕΘ και μετεγχειρητικές λοιμώξεις. Σήμερα αποτελούν το 9-10% των νοσοκομειακών λοιμώξεων και είναι κυρίως λοιμώξεις του αναπνευστικού. Τα είδη που έχουν τη μεγαλύτερη κλινική σημασία είναι εκείνα του Acinetobacter baumannii complex (A. baumannii, A. calcoaceticus, sp.3 &13TU). Τόνισε πως το A. baumannii complex θα πρέπει να διαφοροποιείται από τα άλλα Acinetobacter spp, όπως ο S. aureus από τους CNS, καθώς αυτά σπάνια εμπλέκονται σε λοιμώξεις και επιδημίες, ενώ γενικά απομονώνονται σε ασθενείς με υποκείμενα νοσήματα. Πολλές επιδημίες έχουν σημειωθεί λόγω μόλυνσης επιφανειών και συσκευών, αφού τα Acinetobacter spp επιβιώνουν σε αυτές για μεγάλα χρονικά διαστήματα. Η μετάδοσή τους στον ασθενή γίνεται από τα χέρια του προσωπικού του νοσοκομείου και είναι δυνατόν να περιοριστεί με την εισαγωγή συσκευών και ιατρικών αντικειμένων μιας χρήσης, περιβαλλοντικό καθαρισμό και σωστή απολύμανση χεριών και συσκευών. Επισημάνθηκε ο ρόλος του αποικισμού των ασθενών στη διασπορά της λοίμωξης. Η ανάγκη να αναγνωριστεί το A. baumannii ως σημαντικό παθογόνο σχετίζεται με την ικανότητά του να επιβιώνει και να αναπτύσσει γρήγορα αντοχή στις περισσότερες ομάδες αντιβιοτικών, με αποτέλεσμα να πλεονεκτεί στις ΜΕΘ όπου γίνεται τεράστια χρήση αντιμικροβιακών φαρμάκων. Έτσι η μικροβιακή αντοχή περιορίζει τις θεραπευτικές επιλογές, ειδικότερα όταν τα στελέχη εμφανίζονται ανθεκτικά στις καρβαπενέμες. Οι κλινικές εκδηλώσεις των λοιμώξεων διακρίνονται σε: α) νοσοκομειακές, β) κοινότητος, γ) μετά από πόλεμο και φυσικές καταστροφές (Πίνακας 5). Οι νοσοκομειακές περιλαμβάνουν: βακτηριαιμία [3ο αίτιο σήψης από Gram (-) σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς], μηνιγγίτιδα, λοιμώξεις ουροποιητικού συστήματος, ενδοκαρδίτιδα και πνευμονία. Παράγοντες κινδύνου αποτελούν τα ακόλουθα: μακρά νοσηλεία (ειδικά στη ΜΕΘ), εγχειρήσεις, μηχανικός αερισμός, τραύματα, αποικισμός του εντέρου, θεραπεία με ευρέος φάσματος αντιβιοτικά, εγκατάσταση καθετήρων. Τελευταία αναφέρεται μια ανησυχητική αύξηση σε ό,τι αφορά στις λοιμώξεις της κοινότητας. Αυτές περιλαμβάνουν: βακτηριαιμία, πνευμονία, μηνιγγίτιδα, ενδοκαρδίτιδα, λοιμώξεις μαλακών μορίων και οφθαλμικές λοιμώξεις. Στη βακτηριαιμία η θνητότητα φθάνει το 56% που αποδίδεται σε καθυστέρηση της έναρξης της κατάλληλης αντιβιοτικής αγωγής και συνύπαρξη διαφόρων παραγόντων κινδύνου, όπως: κάπνισμα, αλκοολισμός, χρόνια πνευμονοπάθεια, νεφρική ανεπάρκεια και σακχαρώδης διαβήτης. Βακτηριαιμίες κοινότητας επικρατούν περισσότερο κατά τους θερμούς, υγρούς μήνες, ενώ ενοχοποιούνται ως φορείς μετάδοσης της λοίμωξης στους αστέγους έντομα, όπως ψείρες, ψύλλοι και τσιμπούρια. Στην πνευμονία της κοινότητας το ποσοστό απομό- Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 157 Πίνακας 5. Κλινικές εκδηλώσεις λοιμώξεων από Acinetobacter και παράγοντες κινδύνου. α) Νοσοκομειακές β) Κοινότητος γ) Μετά από φυσικές καταστροφές ή πολεμικές επιχειρήσεις βακτηριαιμία μηνιγγίτιδα λοιμ. ουροποιητικού ενδοκαρδίτιδα πνευμονία βακτηριαιμία πνευμονία ενδοκαρδίτιδα λοιμώξεις μαλακών μορίων και οφθαλμικές λ. εγκαυμάτων λοιμώξεις τραυμάτων πνευμονίες (και άλλες νοσοκομειακές λοιμώξεις) Παράγοντες κινδύνου μακρά νοσηλεία (ΜΕΘ) εγχειρήσεις μηχανικός αερισμός τραύματα θερ. αγωγή με ευρέος φάσματος αντιβιοτικά εγκατάσταση καθετήρων αποίκιση του εντέρου κάπνισμα αλκοολισμός χρ. πνευμονοπάθεια νεφρική ανεπάρκεια σακχαρώδης διαβήτης νωσης Acinetobacter spp κυμαίνεται ευρέως, η δε θνητότητα φθάνει το 40-64% και εμφανίζεται με οξεία εικόνα δύσπνοιας, βήχα και πυρετού που ταχέως εξελίσσεται σε αναπνευστική ανεπάρκεια και shock. Εντυπωσιακά ήταν τα δεδομένα σχετικά με τις λοιμώξεις που ακολουθούν ασυνήθιστες και επείγουσες καταστάσεις, όπως π.χ. στον σεισμό του Μαρμαρά το 1999, όπου απομονώθηκε A. baumannii σε ποσοστό 31,2%, ανάμεσά τους και δύο PDR στελέχη, ενώ πριν το σεισμό το ποσοστό στη ΜΕΘ του ίδιου νοσοκομείου ήταν 7,3%, χωρίς κανένα PDR στέλεχος. Ακόμα MDR Acinetobacter spp αναφέρονται ως τα πιο συχνά απομονωμένα παθογόνα μικρόβια πολεμικής ζώνης (32,5%) σε τραύματα στρατιωτών του Ιράκ, Ιράν, Αφγανιστάν, Πόλεμο του Κόλπου, χαμηλής όμως παθογένειας που μετά από τη λήψη κατάλληλης θεραπείας δεν απομονώθηκαν ποτέ ξανά σε καλλιέργειες που ακολούθησαν. Αναφέρθηκε η επικράτηση του A. baumannii ως κύριο αίτιο νοσοκομειακής πνευμονίας, πιθανώς λόγω της χρήσεως μηχανικού αερισμού αλλά και της υπερανάπτυξης του βακτηρίου στο στομάχι, λόγω των συνθηκών μειωμένης έκκρισης γαστρικού οξέος που συνοδεύει τους νοσηλευόμενους ασθενείς της ΜΕΘ. Το A. baumannii αποτελεί το πιο συχνό αίτιο βακτηριαιμίας στη ΜΕΘ (1,6%) σε σχέση με τη βακτηριαιμία εκτός ΜΕΘ (0,9%), ενώ η θνητότητα που την ακολουθεί είναι 34,0-43,4% και 16,3% αντίστοιχα. Η βακτηριαιμία από A. baumannii έχει την τρίτη σε σειρά υψηλότερη θνητότητα στη ΜΕΘ, μετά από εκείνη της P. aeruginosa και Candida spp. Εμφανίζεται πιο αργά κατά τη διάρκεια της νοσηλείας (~26 μέρες) σε σχέση με βακτηριαιμίες άλλης αιτιολογίας της ΜΕΘ, πηγές της οποίας αποτελούν οι κεντρικές και περιφερικές γραμμές, συνυπάρχουσα πνευμονία, λοίμωξη ουροποιητικού και λοιμώξεις τραύματος. Επίσης το A. baumannii μπορεί να προκαλέσει λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων, ακόμα και σε μη στρατιωτικό πληθυσμό. Απομονώνεται συχνά από εγκαυματικές περιοχές. Αποτελεί ευκαιριακό παθογόνο λοίμωξης ουροποιητικού (1,6%) στις ΜΕΘ και σχετίζεται με τη χρήση καθετήρα Folley και τον αποικισμό του. Δεν είναι συχνό αίτιο ουρολοίμωξης σε εξωνοσοκομειακούς ασθενείς. 158 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Είναι όμως αίτιο μετεγχειρητικής μηνιγγίτιδας σε ασθενείς με βαλβίδα εξωτερικής κοιλιακής παροχέτευσης (drainage), με συνακόλουθη θνητότητα 70%. Ο αριθμός των περιπτώσεων ενδοκαρδίτιδας που αναφέρεται στη βιβλιογραφία είναι μικρός και αφορά σχεδόν πάντα προσθετικές βαλβίδες. Η ενδοφθαλμίτιδα είναι μετεγχειρητική ή οφείλεται σε χρήση φακών επαφής. Αναφέρθηκε επίσης μια περίπτωση αιμορραγικής διάρροιας σε βρέφος 3 μηνών από στέλεχος A. haemolyticus που παρήγαγε τοξίνη Shiga. Τέλος το A. lwoffii ενοχοποιείται για λοίμωξη παρόμοια με εκείνη του H. pylori σε επίμυες, αφού βρέθηκε πως προκαλεί υπερέκκριση γαστρικού υγρού και απελευθέρωση κυτοκινών. Επίσης παράγει ουρεάση που προάγει τον αποικισμό και ινίδια που ευνοούν την προσκόλληση στα γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα. Αυτή η άποψη ενισχύεται από το γεγονός ότι περίπου το 25% των ασθενών με χρόνια γαστρίτιδα είναι αρνητικοί για H. pylori.* Διεύθυνση Επικοινωνίας: Μυρτώ Κατραμάδου Μικροβιολογικό Τμήμα, Γενικού Νοσοκομείου Αθηνών «Γ. Γεννηματάς» ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΗ Σας γνωστοποιούμε ότι η Εταιρεία Κλινικής Μικροβιολογίας και Εργαστηριακής Διαγνωστικής (ΕΚΜΕΔ) έγινε μέλος της Πανελλήνιας Ένωσης Ιατρικής Βιοπαθολογίας (ΠΕΙΒ), μετά από αίτηση του Δ.Σ. της ΕΚΜΕΔ. Η αίτηση έγινε δεκτή από το Δ.Σ. της Ένωσης στις 14/6/2010 και επικυρώθηκε από την Γενική Συνέλευση στις 22/6/2010. Με την συμμετοχή μας στην ΠΕΙΒ θέλουμε να ενώσουμε τις προσπάθειές μας με αυτές των άλλων Εταιρειών της ειδικότητάς μας για την πρόοδο και αναβάθμιση της Ιατρικής Βιοπαθολογίας στη χώρα μας. *Το δεύτερο μέρος του άρθρου θα δημοσιευθεί σε ένα από τα προσεχή τεύχη μας. Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β’, Τόμος 15, Τεύχος 3, σελ. 159-164 2010 ΝΕΑ ΑΠΟ ΣΕΜΙΝΑΡΙΑ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΠΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑΖΟΥΝ ΣΟΒΑΡΑ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΑ ΚΑΙ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΑ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΑΙΚ. ΤΑΡΠΑΤΖΗ, ΚΩΝ. Π. ΤΣΙΒΕΡΙΩΤΗΣ Παρουσιάζονται τα σημαντικότερα συμπεράσματα του 8ου καλοκαιρινού σεμιναρίου της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Κλινικής Μικροβιολογίας και Λοιμωδών Νοσημάτων (8th ESCMID summer school) που πραγματοποιήθηκε στο Πόρτο της Πορτογαλίας από 11 έως 17 Ιουλίου του 2009.Οι συγγραφείς του άρθρου παρακολούθησαν το σεμινάριο με την οικονομική ενίσχυση της Εταιρείας Κλινικής Μικροβιολογίας. Θέματα στα οποία επικεντρώθηκαν οι ομιληταί του σεμιναρίου είναι τα ακόλουθα: 1. Νόσος από C. difficile (καθηγήτρια E. Nagy Παν/μιο Szeged Ουγγαρίας) 2. Ηπατίτιδα Β και C (Δρ. Cr Valente Παν/μιο του Πόρτο) 3. Πυρετός αγνώστου αιτιολογίας (δρ. Μ. Akova Παν/μιο Άγκυρας) 4. Μηχανισμοί αντοχής στα αντιμικροβιακά (L. Loirel Paris-Γαλλία) 5. Λοιμώξεις από αναερόβια μικρόβια (καθηγ. Ε. Nagy Ουγγαρία) 6. Λοιμώξεις σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς (Δρ. J. Garan Παν/μιο Βαρκελώνης) Νόσος από C. difficile Την πρώτη ημέρα του σεμιναρίου η δρ. Εlisabeth Nagy (Πανεπιστήμιο Szeged της Ουγγαρίας), αναφέρθηκε στη διάρροια που προκαλείται από το C. difficile. Οι κυριότεροι προδιαθεσικοί παράγοντες για νόσο από C. difficile, εκτός της χορήγησης αντιβιοτικών, είναι η μεγάλη ηλικία, η παρατεταμένη παραμονή σε νοσοκομείο, η ύπαρξη σοβαρών υποκείμεΕργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας, Νοσοκομείο «Αττικόν», Πανεπιστήμιο Αθηνών. νων νοσημάτων, προηγούμενο χειρουργείο κοιλίας, η ανοσοκαταστολή, η χημειοθεραπεία, οι φλεγμονώδεις νόσοι του εντέρου, η λοχεία, η λήψη γαστροπροστατευτικών φαρμάκων και μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη (ΜΣΑΦ). Παρότι η κλινδαμυκίνη, οι κινολόνες, οι κεφαλοσπορίνες και οι πενικιλίνες είναι τα κυριότερα αντιβιοτικά που ενέχονται στη διάρροια από C. difficile, όλα τα αντιβιοτικά μπορούν να αποτελέσουν προδιαθεσικό παράγοντα. Φαίνεται πως η χρήση τους διαταράσσει τη φυσιολογική χλωρίδα του εντέρου και έτσι ευνοείται ο αποικισμός και η εγκατάσταση του C. difficile στο παχύ έντερο. 160 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Όταν η παραγωγή ειδικών IgG αντισωμάτων είναι επαρκής παρουσιάζεται μόνον ασυμπτωματική φορεία, ενώ στην αντίθετη περίπτωση παράγονται τοξίνες με αποτέλεσμα την κλινική νόσο. Οι ασυμπτωματικοί φορείς αποτελούν σημαντική πηγή μετάδοσης του μικροβίου. Οι κυριότεροι λοιμογόνοι παράγοντες του C. difficile είναι οι τοξίνες Α και Β, οι οποίες παρουσιάζουν κυτταροτοξικές και εντεροπαθογόνες ιδιότητες χαλαρώνοντας τη συνεκτικότητα μεταξύ των συνδέσεων των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων. Το C. difficile ενέχεται στο 11-33% των περιπτώσεων διάρροιας μετά από χρήση αντιβιοτικών, στο 60-75% των περιπτώσεων κολίτιδας συσχετιζόμενης με αντιβιοτικά και σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις ψευδομεμβρανώδους κολίτιδας. Επισημάνθηκε ότι η συχνότητα και η σοβαρότητα της λοίμωξης από το C. difficile έχει αυξηθεί σημαντικά τα τελευταία χρόνια. Αυτή η αύξηση έχει αποδοθεί στην ανάδυση του υπερλοιμογόνου στελέχους NAP1/B1/027 το οποίο ευθύνεται για την εξάπλωση νοσοκομειακών επιδημιών στις Η.Π.Α, τον Καναδά και στην Ευρώπη. Το στέλεχος αυτό συσχετίζεται με σοβαρή νόσο, συχνά ανθεκτική στη θεραπεία και με μεγαλύτερη τάση για υποτροπές. Τα κύρια χαρακτηριστικά του υπερλοιμογόνου C. difficile είναι η υπερπαραγωγή τοξίνης Α και τοξίνης Β, η επιπλέον παραγωγή της «δυαδικής ή διμερούς» τοξίνης, η αντοχή στις κινολόνες και η έντονη σπορογονία. Επιπλέον, τα τελευταία χρόνια παρουσιάστηκαν νοσοκομειακές επιδημίες σε μερικές χώρες από στελέχη που δεν παράγουν τοξίνη Α. Αυτά τα Α-/Β+ στελέχη μπορούν να προκαλέσουν σημαντικά διαγνωστικά προβλήματα στην περίπτωση που το εργαστήριο χρησιμοποιεί ELISA η οποία ανιχνεύει μόνο την τοξίνη Α. Η κλινική εικόνα και ο συνδυασμός διαγνωστικών τεχνικών (απομόνωση του μικροβίου από τα κόπρανα και ανίχνευση παραγωγής τοξινών) οδηγούν στη διάγνωση. Οι κυριότερες μέθοδοι ανίχνευσης των τοξινών του C. difficile είναι οι ανοσοενζυμικές, η ανοσοχρωματογραφία, οι κυτταροκαλλιέργειες και η PCR. Οι ανο- σοενζυμικές μέθοδοι μπορούν να ανιχνεύσουν και τις δυο τοξίνες και να δώσουν γρήγορα αποτελέσματα (2 ώρες). Ωστόσο, δεν παρουσιάζουν υψηλή ευαισθησία (70-80%) και συχνά απαιτείται εξέταση διαδοχικών δειγμάτων. Ο έλεγχος της κυτταροτοξικότητας σε κυτταροκαλλιέργειες έχει υψηλότερη ευαισθησία, αλλά προϋποθέτει εξειδικευμένο προσωπικό, παρουσιάζει υψηλό κόστος και είναι χρονοβόρος. Στις μέρες μας είναι διαθέσιμες στο εμπόριο δύο νέες μοριακές μέθοδοι ανίχνευσης τοξίνης, η BD GeneOhmTM και η Cepheid XpertTM, οι οποίες είναι multiplex, real-time PCR τεχνικές. Η καλλιέργεια κοπράνων σε ειδικά θρεπτικά υλικά για την ανίχνευση του C. difficile είναι η πλέον ευαίσθητη μέθοδος. Παρόλα αυτά είναι χρονοβόρος (48 ώρες) και χρειάζεται την επιπρόσθετη εφαρμογή άλλων μεθόδων για να αποδειχθεί ότι το στέλεχος είναι τοξινογόνο. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στη θεραπεία και την πρόληψη της λοίμωξης από C. difficile. H μετρονιδαζόλη και η βανκομυκίνη αποτελούν τις βασικότερες επιλογές για τη θεραπεία των ασθενών. Πολλά υπόσχονται καινούργιες θεραπευτικές επιλογές που είναι σε ερευνητικό στάδιο και, πιθανότατα, να προσφέρουν σημαντική βοήθεια στο μέλλον. Σε αυτές περιλαμβάνονται η χρήση νέων αντιβιοτικών (ramoplanin, rifaximin, daptomycin, tigecycline, opt-80, nitazoxanide), η χορήγηση εμβολίου, αντισωμάτων ή άλλων ουσιών (tolevamer) που συνδέονται με την τοξίνη του C. difficile. H ορθολογική χρήση των αντιβιοτικών, η έγκαιρη διάγνωση και η εφαρμογή των ενδεδειγμένων μέτρων ελέγχου λοιμώξεων (απομόνωση των πασχόντων, απολύμανση των εκτεθειμένων αντικειμένων, χρήση γαντιών, καλή υγιεινή των χεριών του νοσηλευτικού και ιατρικού προσωπικού) είναι τα κυριότερα μέτρα που μπορούν να συμβάλουν στη μείωση της εξάπλωσης της νόσου. Ηπατίτιδα Β και C H δρ. Cr. Valente (Πανεπιστήμιο του Πόρτο), αναφέρθηκε στη λοίμωξη από τους ιούς της Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 ηπατίτιδας B και C σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς. Επεσήμανε πως η ανοσοκαταστολή προάγει την επανενεργοποίηση, την ιστολογική επιβάρυνση και τη μετάβαση της ηπατίτιδας σε χρονιότητα. Προσέθεσε, δε, ότι η έγκαιρη διάγνωση και η χορήγηση θεραπευτικής αγωγής μπορούν να βελτιώσουν σημαντικά την πρόγνωση των ασθενών. Συνιστάται, όλοι οι ασθενείς στους οποίους πρόκειται να χορηγηθεί χημειοθεραπεία ή άλλου είδους ανοσοκαταστολή να ελέγχονται για λοίμωξη από HBV (ιός ηπατίτιδας Β). Οι ασθενείς που δεν έχουν μολυνθεί θα πρέπει να εμβολιάζονται. Αν είναι HBsAg θετικοί θα πρέπει να τους χορηγηθεί αντι-ιική αγωγή τουλάχιστον 2-4 εβδομάδες πριν την έναρξη της χημειοθεραπείας. Η διακοπή χορήγησης του αντι-ιικού παράγοντα θα πρέπει να γίνεται 6-12 μήνες μετά το τέλος της χημειοθεραπείας. H λοίμωξη από HCV (ιός ηπατίτιδας C) είναι η πιο συχνή αιτία ηπατικής νόσου σε αιμοκαθαιρόμενους. Η νόσος είναι συνήθως ήπια. Παρόλα αυτά η νεφρική μεταμόσχευση έχει ως αποτέλεσμα την ταχύτερη εξέλιξη της ηπατίτιδας και τη συχνότερη εμφάνιση επιπλοκών. Έτσι οι ασθενείς με λοίμωξη από HCV και ειδικότερα εκείνοι με υψηλή τιμή ALT και υψηλά επίπεδα HCV-RNA θα πρέπει να ακολουθούν εντατική αντι-ιική αγωγή πριν από τη λήψη του μοσχεύματος. Η ηπατική μεταμόσχευση είναι η μόνη θεραπευτική επιλογή σε περιπτώσεις σοβαρής κίρρωσης και ηπατοκυτταρικού καρκίνου από HCV. Ωστόσο, στους περισσότερους μεταμοσχευμένους ασθενείς παρατηρείται επανενεργοποίηση της λοίμωξης λόγω της εξωηπατικής παρουσίας του ιού, η εξέλιξη της οποίας επιταχύνεται σημαντικά εξαιτίας της ανοσοκατασταλτικής αγωγής. Περίπου 6-10% των HIV θετικών ασθενών παρουσιάζουν ταυτόχρονα θετικό αυστραλιανό αντιγόνο. Σε αυτές τις περιπτώσεις συνήθως αυξάνονται σημαντικά τα επίπεδα του HBVDNA. Επιπλέον αυξάνεται η πιθανότητα μετάπτωσης της ηπατίτιδας στη χρόνια μορφή 161 της και γενικότερα η θνητότητα. Η ταυτόχρονη παρουσία HIV και HCV συσχετίζεται με αυξημένη πιθανότητα εμφάνισης ηπατοτοξικότητας συσχετιζόμενης με την αντιρετροϊκή αγωγή και τελικά με αυξημένη πιθανότητα αναγκαστικής διακοπής της αγωγής. Αντίστροφα, η λοίμωξη από τον HIV συσχετίζεται με υψηλές τιμές HCV-RNA και επιταχύνει την εξέλιξη της ηπατίτιδας C σε κίρρωση και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. Πυρετός αγνώστου αιτιολογίας O δρ. M. Akova (καθηγητής λοιμωξιολογίας στο Πανεπιστήμιο Hacettepe της Άγκυρας) αναφέρθηκε στον πυρετό αγνώστου αιτιολογίας (fever of unknown origin, FUO) ο οποίος είχε ορισθεί το 1961 από τους Petersdorf και Beeson ως πυρετός μεγαλύτερος από 38,3οC, που διαρκεί τουλάχιστον τρεις εβδομάδες και παραμένει χωρίς αιτιολογική διάγνωση μετά από νοσοκομειακή περίθαλψη και αντίστοιχο έλεγχο του ασθενούς διάρκειας τουλάχιστον 3 ημερών. Τονίστηκε ότι στις μέρες μας έχουν προστεθεί τρεις νέες κατηγορίες πυρετού αγνώστου αιτιολογίας: α) ο νοσοκομειακός, που χαρακτηρίζεται από φυσιολογική θερμοκρασία του ασθενούς κατά την εισαγωγή του στο νοσοκομείο αλλά εμφάνιση πυρετού μεγαλύτερου από 38,3οC για περισσότερες από τρεις μέρες, β) ο πυρετός που συσχετίζεται με την ύπαρξη ανοσοανεπάρκειας και γ) ο πυρετός που συσχετίζεται με τη λοίμωξη από HIV. Στη βιβλιογραφία έχουν αναγνωρισθεί πάνω από 200 αιτίες εμφάνισης πυρετού αγνώστου αιτιολογίας. Οι λοιμώξεις είναι η συχνότερη αιτία (30-40%) και ακολουθούν τα νοσήματα του κολλαγόνου, οι κακοήθεις νόσοι και άλλες σπανιότερες παθήσεις. Στο 5-15% των περιπτώσεων δεν αποκαλύπτεται η αιτία του πυρετού παρά τον ενδελεχή έλεγχο. Οι συνηθέστερες λοιμώξεις που προκαλούν FUO είναι τα αποστήματα, η φυματίωση, η ενδοκαρδίτιδα, η βρουκέλλωση, οι ουρολοιμώξεις, η πνευμονία από CMV, η τοξοπλάσμωση, οι λοιμώξεις από 162 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία χλαμύδια, ρικέτσιες και άλλα. Οι συχνότερες κακοήθεις νόσοι που συσχετίζονται με FUO είναι οι αιματολογικές, ενώ από κακοήθεις επεξεργασίες συμπαγών οργάνων ο καρκίνος του νεφρού είναι ο πιο συχνός. Διάφορα νοσήματα του κολλαγόνου, αγγειΐτιδες, φλεγμονώδη νοσήματα του εντέρου και σπάνιες παθήσεις (π.χ. οικογενής μεσογειακός πυρετός) μπορούν να προκαλέσουν πυρετό ως πρωταρχικό σύμπτωμα. Στις μικρές ηλικίες οι λοιμώξεις είναι συνήθως η αιτία του πυρετού, ενώ στην περίπτωση των ηλικιωμένων ασθενών αυξάνεται η συχνότητα των νοσημάτων του κολλαγόνου (π.χ. κροταφική αρτηρίτιδα και ρευματική πολυμυαλγία) και των νεοπλασιών. Η διαγνωστική προσέγγιση των αρρώστων με FUO περιλαμβάνει λεπτομερές ιστορικό, κλινική εξέταση, εξέταση ούρων, γενική αίματος, βιοχημικές εξετάσεις, ακτινογραφία θώρακος, έλεγχο νοσημάτων του κολαγόνου, αιμοκαλλιέργειες, αναζήτηση ειδικών αντισωμάτων (π.χ. έναντι CMV, HIV κ.ά.). Η εφαρμογή άλλων εξετάσεων, όπως αξονική τομογραφία κοιλίας, σπινθηρογράφημα, Doppler κάτω άκρων, βιοψία κροταφικής αρτηρίας ή ήπατος, θα πρέπει να βασίζεται σε κλινικές ενδείξεις. Μηχανισμοί αντοχής Ο L. Poirel (Βακτηριολογικό και Ιολογικό τμήμα του Hopital de Bicetre του Παρισιού) αναφέρθηκε στους μηχανισμούς αντοχής των εντεροβακτηριακών, του Acinetobacter baumannii και της Pseudomonas aeruginosa. Τα εντεροβακτηριακά, και ειδικότερα το γένος Klebsiella spp., παράγουν ευρέος φάσματος β-λακταμάσες (extended-spectrum β-lactamases, ESBLs) τύπου SHV και TEM, οι οποίες αναστέλλονται από τους αναστολείς β-λακταμασών. Επιπλέον, από τη δεκαετία του 2000, απομονώθηκαν εντεροβακτηριακά (κυρίως Escherichia coli) που παράγουν νεότερες ESBLs, τα ένζυμα CTX-M. Τα συγκεκριμένα ένζυμα είναι β-λακταμάσες τάξης Α προερχόμενες από το γένος Kluyvera, ταξινομούνται σε πέντε υποομάδες (CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 και CTX-M25) και αναστέλλονται από την ταζοβακτάμη. Άλλοι, λιγότερο συχνοί τύποι ESBLs, είναι οι GES, οι οποίες είναι πλασμιδιακές, υδρολύουν την κεφταζιδίμη σε μεγαλύτερο βαθμό από ό,τι την κεφοταξίμη και αναστέλλονται αποτελεσματικότερα από την ταζοβακτάμη και λιγότερο από το κλαβουλανικό οξύ. Οι PER ESBLs είναι χρωμοσωμικές ή πλασμιδιακές και έχουν ανευρεθεί κυρίως σε νοσοκομειακά στελέχη Acinetobacter spp. και P. aeruginosa. Σχετικά με την ανίχνευση των ESBLs στα κλινικά εργαστήρια, οι δοκιμασίες πρώτης γραμμής είναι η δοκιμή συνέργειας δύο δίσκων (DDST) και η δοκιμασία των δίσκων συνδυασμού κεφαλοσπορίνης και κλαβουλανικού οξέος (combined discs): CAZ/CAZ+CLAV, CTX/ CTX+CLAV, FEP/FEP+CLAV. Οι επιβεβαιωτικές μέθοδοι δεύτερης γραμμής, είναι ο προσδιορισμός της MIC των κεφαλοσπορινών ευρέος φάσματος με και χωρίς κλαβουλανικό οξύ με αραιώσεις σε ζωμό καθώς και το E-test ESBL. Αναφέρθηκαν επίσης οι β-λακταμάσες τύπου AmpC (κεφαλοσπορινάσες), οι οποίες ανήκουν στην τάξη C κατά Ambler. Η έκφρασή τους μπορεί να είναι επαγώγιμη ή αποκατασταλμένη (μόνιμη υπερπαραγωγή). Υδρολύουν όλα τα β-λακταμικά, εκτός από την κεφεπίμη και τις καρβαπενέμες και δεν αναστέλλονται από τους αναστολείς β-λακταμασών. Για την ανίχνευση των AmpC προτείνονται η αξιολόγηση του φαινοτύπου αντοχής, η επαγωγή παρουσία δισκίου κεφοξιτίνης, η αναστολή παρουσία βορονικού οξέος ή κλοξακιλλίνης και το E-test Cefotetan/Cefotetan+Cloxacillin. Όσον αφορά τις καρβαπενεμάσες, αυτές ταξινομούνται σε τάξης Β (μεταλλο-ένζυμα), τάξης Α και τάξης D (ΟΧΑ- καρβαπενεμάσες). Οι μεταλλο-β-λακταμάσες (metallo-βlactamase, MBL) ταξινομούνται σε 4 τύπους (IMP,VIM, SPM και GIM). Τα ένζυμα υδρολύουν όλα τα β-λακταμικά εκτός της αζτρεονάμης και αναστέλλονται από το EDTA. Για την ανίχνευση καρβαπενεμασών τάξης Β, χρησιμοποιείται το E-test MBL και το EDTA όπου αξιο- Περίοδος B’, Τόμος 15, Τεύχος 3, 2010 λογείται η συνέργεια με τα δισκία ιμιπενέμης ή μεροπενέμης. Επισημάνθηκε η ανάδυση στελεχών παγκοσμίως που παράγουν πλασμιδιακές καρβαπενεμάσες τάξης Α του τύπου KPC. Για την ανίχνευση της παραγωγής KPC, προτείνεται η χρησιμοποίηση δισκίων μεροπενέμης με 400 μg βορονικού οξέος. Αναφέρθηκαν επίσης οι μηχανισμοί αντοχής που εμφανίζει η P. aeruginosa και το A. baumannii. Ο κύριος μηχανισμός αντοχής στην P. aeruginosa είναι η απώλεια πορινών και η αποκαταστολή της έκφρασης της χρωμοσωμιακής AmpC. H παραγωγή MBL και ESBL δεν είναι συχνή στην Ευρώπη, με εξαίρεση την Ελλάδα, όπου συχνά απομονώνονται στελέχη P. aeruginosa που παράγουν MBL. Όσον αφορά το A. baumannii, το πρόβλημα συνδέεται με την παγκόσμια εμφάνιση στελεχών ανθεκτικών στις καρβαπενέμες. Αυτά τα στελέχη παράγουν κυρίως τάξης D καρβαπενεμάσες (carbapenemhydrolyzing class D β-lactamases,CHDLs), οι οποίες είναι πλασμιδιακές ή χρωμοσωμικές. Τέλος, η αντοχή του A. baumannii στις καρβαπενέμες μπορεί να είναι αποτέλεσμα τροποποίησης των πορινών. Αναερόβια μικρόβια Η δρ. E. Nagy αναφέρθηκε, επίσης, στις λοιμώξεις που προκαλούνται από αναερόβια βακτήρια. Τα αναερόβια αποικίζουν τον ανθρώπινο οργανισμό σε αναλογία 1:1000 σε σχέση με τους αερόβιους μικροοργανισμούς και μπορεί να προκαλέσουν απειλητικές για τη ζωή λοιμώξεις. Στο κλινικό εργαστήριο, υπάρχουν προβλήματα όσον αφορά την απομόνωση και ταυτοποίηση των αναεροβίων. Τα αυτοματοποιημένα συστήματα ταυτοποίησης και προσδιορισμού αντοχής δεν αποτελούν τη βέλτιστη διαγνωστική προσέγγιση. Επιπλέον, λίγα μικροβιολογικά εργαστήρια χρησιμοποιούν lege artis διαγνωστικές τεχνικές. Οι κυριότερες λοιμώξεις από αναερόβια που έχουν αναφερθεί, είναι η βακτηριαιμία, το σύνδρομο Lemierre, το έλκος διαβητικού 163 ποδιού, η χρόνια ιγμορίτιδα και ωτίτιδα, η περιτονίτιδα και οι λοιμώξεις από δήγμα ζώου ή ανθρώπου. Για την εικοσαετία 1960-1980, έχουν δημοσιευθεί συχνότητες βακτηριαιμίας από αναερόβια 5-20% (B. fragilis group: 60-75%, Clostridium spp: 10-20%, Peptostreptococcus spp: 10-15%, Fusobacterium spp: 10-15%, P. acnes: 2-5%), ενώ τα επόμενα χρόνια υπήρξε μείωση της επίπτωσης βακτηριαιμιών από αναερόβια, γεγονός που οφείλεται στην προφυλακτική χορήγηση μετρονιδαζόλης και άλλων νέων αντιβιοτικών, αλλά και στη βελτίωση των χειρουργικών τεχνικών. Εκτενής αναφορά έγινε στο σύνδρομο Lemierre και στα έλκη διαβητικού ποδιού. Το σύνδρομο Lemierre οφείλεται συνήθως στο Fusobacterium necrophorum. Πρόκειται για αρνητικό κατά Gram βακτηρίδιο, το οποίο αποτελεί μέλος της φυσιολογικής χλωρίδας της στοματικής κοιλότητας, του γαστρεντερικού σωλήνα και του κόλπου. Το σύνδρομο μπορεί να προκληθεί και από άλλους μικροοργανισμούς, (π.χ. Peptostreptococcus spp, Bacteroides spp), ενώ μπορεί να έχει πολυμικροβιακή αιτιολογία. Η συχνότητά του κυμαίνεται μεταξύ 0,6-2,3/ εκατομμύριο πληθυσμού και η θνητότητά του από 4%-18%. Αποτελεί σπάνια επιπλοκή λοίμωξης του ανωτέρου αναπνευστικού. Αρχικά προσβάλλεται ο περιαμυγδαλικός ιστός και στη συνέχεια η λοίμωξη μπορεί να επεκταθεί στην περιφαρυγγική περιοχή. Η λοίμωξη της έσω σφαγίτιδας μπορεί να οδηγήσει σε θρομβοφλεβίτιδα. Η βακτηριαιμία είναι επακόλουθο της θρομβοφλεβίτιδας και προκαλεί μεταστατικές σηπτικές εστίες κυρίως στους πνεύμονες και τα οστά. Τα έλκη διαβητικού ποδιού εμφανίζονται στο 2-5% των διαβητικών ασθενών. Στις διάφορες μελέτες η συχνότητα απομόνωσης αναεροβίων κυμαίνεται από 15% έως 75%. Συχνότερα απομονώνονται Peptostreptococci και Bacteroides. Όσον αφορά την απομόνωση των μικροοργανισμών, συνιστάται καθαρισμός του τραύματος και σωστός τρόπος λήψης του δείγματος από τη βάση του έλκους με βαμβακοφό- 164 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία ρο στυλεό. Ο ενοφθαλμισμός πρέπει να γίνεται σε αιματούχο, σοκολατόχρωμο, McConkey άγαρ, Sabouraud και σε θρεπτικά υλικά αναεροβίων, όπως Brucella blood agar, Bacteroides bile esculin και Colistin- nalidixic acid agar. Από τον Δρ. J. Garau (Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης) αναπτύχθηκε το θέμα της πνευμονίας σε ουδετεροπενικούς ασθενείς η οποία είναι δυνητικά απειλητική για τη ζωή. Το γεγονός αυτό καθιστά αναγκαία την ταχεία διάγνωση. Σύμφωνα με τον ομιλητή, μια συστηματική μελέτη που έγινε στη χώρα του και αφορούσε την αξιολόγηση πρωτοκόλλου που περιελάμβανε εξετάσεις πτυέλων, βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος (brochoalveolar lavage, BAL), διαβρογχικής βιοψίας, συμβατικές μικροβιολογικές εξετάσεις και ανίχνευση αντιγόνων, έδειξε ότι η εξέταση BAL συνέβαλε σημαντικά στη διάγνωση πνευμονίας σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς. Μικροοργανισμοί που ενδέχεται να ενέχονται σε βακτηριακή πνευμονία είναι Gram θετικά και Gram αρνητικά βακτήρια. Η ψευδομοναδική πνευμονία σε ουδετεροπενικούς ασθενείς με πνευμονικά διηθήματα, έχει κακή πρόγνωση και η προληπτική κάλυψη αυτής της ομάδας ασθενών είναι απαραίτητη. Η απόφαση κάλυψης του χρυσίζοντος σταφυλόκοκκου ανθεκτικού στη μεθικιλλίνη (MRSA) πρέπει να βασίζεται σε τοπικούς επιδημιολογικούς παράγοντες. Η Legionella pneumophila αποτελεί ένα από τα 20 είδη Legionella, τα οποία θεωρούνται παθογόνα για τον άνθρωπο. Η πλειονότητα των λοιμώξεων από είδη μηpneumophila Legionella εμφανίζεται σε ανοσοκατασταλμένους και σπληνεκτομηθέντες ασθενείς. Η πνευμονία από CMV (cytomegalovirus), παραμένει μια σημαντική αιτία νοσηρότητας και θνητότητας σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς, ιδιαίτερα σε ασθενείς που έχουν υποβληθεί σε αλλογενή μεταμόσχευση μυελού. Σε αυτή την κατηγορία ασθενών η CMV πνευμονία παρουσιάζει επίπτωση 15% και συνδέεται με θνητότητα 85% αν δεν χορηγηθεί έγκαιρα. Θεραπευτική αγωγή Οι μοριακές τεχνικές (real time PCR, συμβατική PCR) στο αίμα ή στο BAL, καθώς και η ανίχνευση αντιγόνου στο αίμα υπερτερούν σε σχέση με την κυτταροκαλλιέργεια. Σημαντική είναι και η συμβολή της διαβρογχικής βιοψίας με την ανίχνευση των χαρακτηριστικών κυττάρων. Αν και ο CMV είναι ο κυριότερος ιός που απειλεί ανοσοκατασταλμένους ασθενείς, σημαντικό ρόλο φαίνεται να παίζουν και άλλοι αναπνευστικοί ιοί (π.χ. αναπνευστικός συγκυτιακός ιός, και ανθρώπινος μεταπνευμονο-ιός). Οι ουδετεροπενικοί ασθενείς, που έχουν λάβει υψηλές δόσεις κυτταροτοξικών φαρμάκων, εμφανίζουν αυξημένο κίνδυνο πνευμονίας από Pneumocystis jirovecii. Η PCR παρουσιάζει υψηλή ευαισθησία αλλά δεν διαχωρίζει τον αποικισμό από τη λοίμωξη. Έχει αποδειχθεί ότι τα προκλητά πτύελα αποτελούν χρήσιμο κλινικό δείγμα που επιπλέον εφαρμόζεται αποτελεσματικά και σε κέντρα θεραπείας ασθενών με AIDS. Σε ασθενείς που πάσχουν από αιματολογικές κακοήθειες, έχει αυξηθεί τις τελευταίες δύο δεκαετίες η επίπτωση των διηθητικών μυκητιασικών λοιμώξεων, ιδιαίτερα λοιμώξεων από ασπέργιλλο. Μύκητες όπως το Fusarium εμφανίζουν μεγάλη κλινική σημασία και πρέπει να περιλαμβάνονται στη διαφορική διάγνωση. Τέλος έγινε αναφορά στην αναπνευστική λοίμωξη από κρυπτόκοκκο, η κλινική εικόνα της οποίας ποικίλλει από ασυμπτωματική έως βαριά πνευμονία και αναπνευστική ανεπάρκεια. Διεύθυνση Επικοινωνίας: Κωνσταντίνος Τσιβεριώτης, Επικουρικός ιατρός-Βιοπαθολόγος, Εργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας, Αττικό Νοσοκομείο, Ρίμινι 1, Χαϊδάρι 12462, Αθήνα Τηλέφωνο εργασίας: 210-5831910 Κινητό: 6937121545 e-mail: kptsiv@infotrade.gr Πρόγραμμα Παρουσίασης Περιπτώσεων της Εταιρείας Κλινικής Μικροβιολογίας και Εργαστηριακής Διαγνωστικής Περιόδου 2010-2011 Αμφιθέατρο Νοσοκομείου Παίδων «Αγία Σοφία», (ώρα 14.30-15.30 μ.μ.) 9/11/2010 «Λοίμωξη του ουροποιητικού συστήματος σε ασθενή της ΜΕΘ» Ορφανίδου Μ.1, Κατραμάδου Μ.1, Τσακαλάκης Γ.2, Τσανικλίδου Σ.1, Καραμπίνης Α.2, Μαλάμου-Λαδά Ε.1 1 Μικροβιολογικό Τμήμα και 2ΜΕΘ Γενικού Νοσοκομείου «Γ. Γεννηματάς» 14/12/2010 «Σπάνια περίπτωση ενδοκαρδίτιδας» Ζέρβα Λ.1, Συμπάρδη Σ.2, Κωτάκος Χ.3, Σιαφάκας Ν.1, Τσιόδρας Σ.2, Παντελάκη Μ.1, Οικονομίδης Ι.3, Γιαννιτσιώτη Ε.2, Πετεινέλλη Ε.4, Ραλλίδης Λ.3, Κρεμαστινός Δ.3 1 Εργ. Κλινικής Μικροβιολογίας, 2Δ΄ Παθ. Κλινική, 3Β΄ Καρδ. Κλινική «Αττικό» Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή Παν. Αθηνών, 4Μικρ. Εργ. Νοσοκομείο «Αγία Βαρβάρα», Αθήνα. 11/1/2011 «Χρόνια ηωσινοφιλία σε ανοσοκατασταλμένο ασθενή» Σταμούλος Κ.1, Κεχαγιά Μ.1, Σκαρμούτσου Ν.1, Μίτζηρας Ι.1, Λαδά Μ.2, Μαρτσούκου Μ.1, Φακίρη Ε.1 1 Α΄ Μικροβιολογικό Τμήμα και 2Β΄ Παθολογική Κλινική «Σισμανόγλειο» Γ.Ν.Α. 8/2/2011 «Λοίμωξη μαλακών μορίων βραχίονος κτηνοτρόφου» Αθανασοπούλου Β.1, Μπάλκου Π.1, Αυγερινού Ε.1, Πετρίδης Α.2, Σταύρου Α.1, Παπαδογεωργάκη Ε.1 Μικροβιολογικό Τμήμα1, 3η Δερματολογική Κλινική2 Νοσοκομείου Δερματικών και Αφροδισιακών Νοσημάτων «Ανδρέας Συγγρός» 8/3/2011 «Δύο περιπτώσεις πυρετού αγνώστου αιτιολογίας» Πουλοπούλου Χ.1, Λαζαρίδου Α.1, Γιαννούλη Α.1, Σερέτη Α.2, Δριμής Σ.2, Γιαννέλη Δ.1, Βουτσινάς Δ.2, Παπαδάκης Γ.3, Θέμελη-Διγαλάκη Κ.1 1 Τμήμα Κλινικής Μικροβιολογίας, 2Γ΄ Παθολογικό Τμήμα και 3Νεφρολογικό Τμήμα «Τζανείου» Γενικού Νοσοκομείου 12/4/2011 «Μυκηταιμία σε ασθενή της ΜΕΘ» Παπαϊωάννου Β.1, Ντέτσικα Κ.1, Τσιπλάκου Σ.1, Στυλιανάκης Α.1, Παρασκευόπουλος Ι.2, Κουτσούκου Α.1, Μητρούσια-Ζιούβα Α.3 1 Μικροβιολογικό Τμήμα, 2Α΄ Γενική Χειρουργική Κλινική Γενικό Νοσοκομείο Αττικής «ΚΑΤ», 3Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή Πανεπιστήμιο Αθηνών 10/5/2011 Η Συνεδρίαση του Μαΐου δεν θα πραγματοποιηθεί διότι συμπίπτει με το 21ο Συνέδριο της ESCMID στο Μιλάνο 7-10/5 10/6/2011 «Απομόνωση ατύπων μυκοβακτηριδίων από κλινικά δείγματα» Παπαβέντζης Δ., Καράμπελα Σ., Κωνσταντινίδου Ε., Μαρίνου Ι., Ιωαννίδης Π., Νικολάου Σ. Μικροβιολογικό Τμήμα - Κέντρο Αναφοράς Μυκοβακτηριδίων Π.Ν.Ν.Θ. «Η Σωτηρία» Θα δοθεί πιστοποιητικό παρακολούθησης σε όσους παρακολουθήσουν τις 6 από τις 7 συνεδριάσεις Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β’, Τόμος 15, Τεύχος 3, σελ. 166 2010 ΒΡΑΒΕΙΟ «ΑΝΤΙΓΟΝΗ ΑΡΣΕΝΗ» Η Εταιρεία Κλινικής Μικροβιολογίας και Εργαστηριακής Διαγνωστικής έχει θεσμοθετήσει ένα βραβείο αξίας χιλίων Ευρώ προς τιμήν της Καθηγήτριας της Μικροβιολογίας και Ιδρυτού της Εταιρείας κας Αντιγόνης Αρσένη για πρωτότυπες μελέτες στην Κλινική Μικροβιολογία. Όροι του Διαγωνισμού 1.Οι μελέτες πρέπει να έχουν πραγματοποιηθεί καθ’ ολοκληρίαν στην Ελλάδα, να αφορούν θέματα εφαρμοσμένης έρευνας στην Κλινική Μικροβιολογία και να μην έχουν δημοσιευθεί ολικώς ή μερικώς. 2.Οι μελέτες πρέπει να υποβληθούν σε πέντε αντίτυπα με ελληνική και αγγλική περίληψη. Η συνολική έκταση της μελέτης (κείμενο, περιλήψεις, εικόνες-πίνακες και βιβλιογραφία) δεν πρέπει να είναι μεγαλύτερη από είκοσι δακτυλογραφημένες σελίδες σε μία όψη και περίπου 30 στίχους σε κάθε σελίδα. Για τη σύνταξη του κειμένου, τη βιβλιογραφία κ.λπ. πρέπει να τηρηθούν οι «Οδηγίες για τους συγγραφείς» του περιοδικού Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική. Στο τέλος της εργασίας πρέπει να υπάρχει ιδιαίτερο κείμενο έως 50 λέξεις, στο οποίο να αναφέρεται η πρόοδος που προκύπτει από την έρευνα, καθώς και περίληψη δακτυλογραφημένη στην ειδική φόρμα του Μικροβιολογικού Συνεδρίου. 3.Για το αδιάβλητο της κρίσης, οι μελέτες που θα υποβληθούν, δεν πρέπει να αναφέρουν το όνομα των συγγραφέων καθώς και στοιχεία από τα οποία να είναι δυνατή η αναγνώριση της προέλευσης της εργασίας. Σε ιδιαίτερο φάκελο σφραγισμένο, θα υπάρχει σημείωμα με το ονοματεπώνυμο των συγγραφέων, τη διεύθυνση, το τηλέφωνο και την προέλευση της εργασίας. 4.Οι μελέτες θα κριθούν από Ειδική Επιτροπή, αποτελούμενη από μέλη της Ελληνικής Μικροβιολογικής και Εργαστηριακής Διαγνωστικής. Στην κρίση θα ληφθούν υπόψη: α. η πρωτοτυπία της ερευνητικής ιδέας β. ο σχεδιασμός και η μεθοδολογία γ. η βιβλιογραφική τεκμηρίωση και δ. η συμβολή στην πρόοδο και εξέλιξη της Κλινικής Μικροβιολογίας, που θα απορρέει από τα αποτελέσματα της μελέτης. 5.Η μελέτη που θα βραβευθεί θα ανακοινωθεί στο 5ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκομειακών Λοιμώξεων που θα γίνει στις 10-12 Φεβρουαρίου 2011, περίληψή της θα συμπεριληφθεί στα Πρακτικά του Συνεδρίου, ολόκληρη δε η εργασία θα δημοσιευθεί στο περιοδικό «Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική». Οι μη βραβευμένες μελέτες θα προωθηθούν για κρίση, όπως και οι άλλες εργασίες του Συνεδρίου. 6.Οι μελέτες πρέπει να κατατεθούν στην «ASCENT» έως τη λήξη της προθεσμίας κατάθεσης των Εργασιών του Συνεδρίου. Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β’, Τόμος 15, Τεύχος 3, σελ. 167 2010 ΡΩΤΟΥΜΕ - ΑΠΑΝΤΟΥΜΕ - ΜΑΘΑΙΝΟΥ ΜΕ Ερώτηση 1η Ασθενής 53 ετών παρουσιάζει πυρετό και εστιακά νευρολογικά σημεία. Η μαγνητική τομογραφία εμφανίζει βλάβη στον αριστερό κροταφικό λοβό. Ποια από τις ακόλουθες διαγνωστικές μεθόδους είναι η πιο κατάλληλη για την επιβεβαίωση εγκεφαλίτιδας από ιό του απλού έρπητα; Α. Βιοψία εγκεφάλου Β. Χρώση άμεσου επιχρίσματος Γ. PCR στο ΕΝΥ Δ. Ορολογική δοκιμασία για την ανίχνευση IgM αντισωμάτων Ερώτηση 2η Ποιος από τους ακόλουθους ιούς προκαλεί συχνότερα μεγάλες επιδημίες γαστρεντερίτιδας; Α. Adeno-ιός Β. Rota-ιός Γ. Astro-ιός Δ. Noro-ιός Ερώτηση 3η Ποια από τις ακόλουθες δοκιμασίες είναι η πιο κατάλληλη για την οριστική διάγνωση άσηπτης μηνιγγίτιδας από μη πολιο-εντεροϊούς; Α. Η απομόνωση με καλλιέργεια Β. Η ανίχνευση του DNA του ιού με RT-PCR Γ. Η αναζήτηση IgM αντισωμάτων σε ορό ή ΕΝΥ Ερώτηση 4η Για τη διάγνωση στο εργαστήριο της ερπητικής πρωτολοίμωξης με πρόσφατες βλάβες των έξω γεννητικών οργάνων, ποιον από τους ακόλουθους προσδιορισμούς θα επιλέξετε; Α. IgG και IgM αντισώματα στον ορό με PCR Β. IgG και IgM αντισώματα στον ορό με EIA Γ. Αντιγόνο του ιού στις βλάβες με άμεσο ανοσοφθορισμό Δ. DNA του ιού στις βλάβες με PCR Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β’, Τόμος 15, Τεύχος 3, σελ. 168 2010 ΣΥΝΕΔΡΙΑ - ΣΕΜΙΝΑΡΙΑ 3-7 October 2010 Infectious Diseases in Pregnant women, Fetuses and Nowborne Bologna, Italy 4-5 Νοεμβρίου 2010 3ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ελέγχου Λοιμώξεων Ίδρυμα Ευγενίδου, Αθήνα Τηλ. Γραμ.: 210 9854313 3-7 October 2010 Salmonella Villars-sur-Ollon Switzerland ESCMID/FEMS Conference www.escmid. org info@escmid.org 4-5 November 2010 Hot Topics in Lower Respiratory tract infections Budapest, Hungary GRACE Workshop 10-13 October 2010 7th International Conference of the Hospital Infection Society Liverpoool www.his2010.com 2-5 November 2010 Intracellular Bacteria: from Biology to Clinic Sousse, Tunisia ESCMID Postgraduate Education Course 3-5 November 2010 ICAR 2010 International Conference on Antimicrobial Research Valladolid Spain www.formatex.org 10-12 Νοεμβρίου 2010 21ο Πανελλήνιο Αιματολογικό Συνέδριο Θεσσαλονίκη www.eae.gr 17-19 November 2010 Federation of infection Societies Edinburgh International Conference Centre www.fis2010.co.uk 5-8 December 2010 22nd Annual National Forum on Quality Improvement in Health Care Orlando, Florida USA www.ihi.org 13-15 January 2011 European Society of Clinical Virology Institute for Child Health London www.escv.org/meetings/meeting.asp
© Copyright 2024 Paperzz
