Criticità nella misura dei metodi di dosaggio dell

Criticità nella misura dei metodi di
dosaggio dell’aldosterone
dell aldosterone
Aldo Clerico
Scuola Superiore Sant’Anna
Fondazione Regione Toscana G. Monasterio
clerico@ftgm.it
INTRODUZIONE
Il dosaggio dell’Aldosterone nel siero e nelle urine
presenta notevoli
li criticità
i i i à a causa dei
d i livelli
li lli
circolanti estremamente bassi (dell’ordine di poche
decine di pg/mL) e della presenza contemporanea
nelle matrici biologiche di una grande quantità di
possibili interferenti.
I metodi di dosaggio comunemente utilizzati nei
laboratori di analisi cliniche per la misura
dell’aldosterone sono immunodosaggi di tipo
competitivo.
competitivo
INTRODUZIONE
Fin dagli anni ‘70 del secolo scorso sono stati messi
a punto i primi metodi RIA per il dosaggio
dell’ormone, che generalmente si avvalevano di
uno step preliminare di estrazione e/o purificazione
cromatografica per cercare di ridurre le
interferenze specifiche e aspecifiche, e di
aumentare la sensibilità analitica complessiva del
dosaggio.
dosaggio
Negli anni successivi sono stati prodotti antisieri e
anticorpi monoclonali a più alta affinità e
specificità che hanno permesso la messa a punto di
metodi competitivi diretti,
diretti sia RIA che EIA.
EIA
INTRODUZIONE
Infine, in questi ultimi anni sono stati sviluppati
anche
h
kit commerciali
i li per il dosaggio
d
i
dell’aldosterone
utilizzabili
su
piattaforme
automatizzate.
Sono stati messi a punto anche metodi che
utilizzano la spettrometria di massa con
preliminare estrazione cromatografica HPLC
(tecnica liquido-massa), ma questi metodi non sono
ancora molto
lt utilizzati
tili ti nella
ll routine
ti clinica
li i a causa
della scarsa praticabilità sperimentale di questa
tecnica; tuttavia, questa tecnologia potrebbe essere
considerata la metodica sui cui calibrare i materiali
di riferimento.
STUDIO MULTICENTRICO
I risultati che saranno presentati sono il
risultato di uno studio multicentrico che è
stato eseguito in collaborazione tra il
laboratorio della Fondazione CNR-Regione
Toscana G. Monasterio di Pisa, il laboratorio
di C
d
Chimica
ca C
Clinica
ca de
dell’Ospedale
Ospeda e Sa
San Bortolo
o to o
di Vicenza e lo spin-off del CNR
QualiMedLab di Pisa.
STUDIO MULTICENTRICO
Abbiamo valutato le caratteristiche analitiche ed i risultati
clinici ottenuti con due nuovi metodi di misura
dell’aldosterone
dell
aldosterone che utilizzano le piattaforme automatizzate
LIAISON (DiaSorin) e iSYS (Distribuito in Italia da Pantec).
In particolare,
particolare sono stati confrontati i valori di aldosterone
misurati con la piattaforma LIAISON e la piattaforma iSYS
con quelli ottenuti, sugli stessi campioni, con il metodo RIA
ALDO CTK (DiaSorin).
ALDO-CTK
(Di S i )
Sono stati,
stati inoltre,
inoltre misurati con queste piattaforme dei
campioni di controllo distribuiti nella VEQ Immunocheck ed
i valori trovati sono stati confrontati con quelli ottenuti dai
laboratori partecipanti con i metodi di dosaggio
dell’aldosterone più utilizzati in Italia.
DOSAGGIO COMPETITO AUTOMATIZZATO
PER LA PIATTAFORMA LIAISON
CBG
Aldosterone
+
Assay
buffer
+
Solid Phase
Microparticelle con Ab anti-pecora e
MoAb anti-Aldosterone in pecora
100 µL Campione
Solid Phase
+
Solid Phase
Aldosterone
Coniugato con un
derivato
dell’isoluminolo
Lavaggio
TAT circa 55 minuti
Lettura
6 sec
DOSAGGIO COMPETITIVO AUTOMATIZZATO
PER LA PIATTAFORMA IDS-iSYS
Aldosterone
+
Anticorpo
monoclonale
biotinilato
antialdosterone
Aldosterone
coniugato con
estere di
acridinio
Particelle magnetiche legate
a streptavidina
Lavaggio
gg
200 µL Campione
Lettura
TAT circa 45 minuti
METODO RIA PER L’ALDOSTERONE
Il metodo RIA ALDO-CT (DiaSorin, Saluggia) viene
utilizzato per la routine clinica nel nostro laboratorio da
molti anni.
Questo metodo RIA utilizza aldosterone marcato con 125I
come tracciante, che compete con l’aldosterone presente nei
calibratori, controlli e campioni per il legame all’anticorpo
fissato su provette sensibilizzate.
Dopo 18-22 ore di incubazione viene eliminato il non legato
mediante aspirazione
p
e p
poi è misurata la radioattività
mediante contatore gamma.
La q
quantità di aldosterone marcato legata
g
è inversamente
proporzionale alla concentrazione di aldosterone presente
nei calibratori, controlli e campioni dei pazienti.
CAMPIONI DI PLASMA UTILIZZATI
NELLO STUDIO
Nel presente studio, sono stati utilizzati campioni di plasma
di p
pazienti afferenti agli
g ambulatori,, al day-service
y
o
ricoverati presso il reparto di medicina cardiovascolare
della Fondazione Toscana Gabriele Monasterio (Pisa,
Italia).
Il prelievo di sangue è stato eseguito tra le 08:00 e le 09:00
dopo una notte di digiuno e dopo 15 min in posizione
“sed ta”
“seduta”.
I campioni di sangue (8–10 mL) sono stati raccolti in tubi di
polipropilene contenenti EDTA e subito centrifugati per 15
min a 4°C.
Il plasma ottenuto è stato poi congelato e conservato a –20
20
°C in aliquote da 0.5 mL in provette di polistirene fino al
momento del dosaggio.
CAMPIONI DI PLASMA DI SOGGETTI
SANI U
S
UTILIZZATI NELLO
OS
STUDIO
U O
Per valutare i limiti di riferimento, sono stati reclutati in
totale 147 soggetti apparentemente sani di cui 59 maschi
(età 48.0 ± 11.7 anni) e 88 femmine (età 51.0 ± 10.8 anni).
La maggior
L
i parte
t dei
d i soggetti
tti sanii con età
tà > 40 annii sono
stati arruolati nello studio MELHP, che è uno studio di
screening che ha lo scopo di valutare la presenza di
patologie cardiovascolari subcliniche in una popolazione
generale asintomatica della comunità di Montignoso
(Massa, Italia).
Infine, sono stati utilizzati anche 12 campioni di controllo
distribuiti nella valutazione esterna di q
qualità ((VEQ)
Q)
Immunocheck (Ormoni 2) di QualiMedLab nel corso del
ciclo annuale 2013.
Valutazione della sensibilità e riproducibilità
analitica del metodo LIAISON
Il limite del bianco (LoB) e di rivelazione (LoD) sono stati
determinati in accordo con il p
protocollo CLSI EPI17-A.
Il valore del LoB è stato calcolato valutando l’errore medio nella
lettura del segnale di una soluzione non contenente aldosterone
(soluzione fisiologica), misurandola 65 volte in 5 sedute analitiche
differenti, utilizzando due differenti lotti di calibratori.
Il valore del LoD è poi stato calcolato secondo la formula: LoD =
LoB + 1.645 SD, dove la SD è stata calcolata su un pool di plasma
con bassa concentrazione di aldosterone, misurato 20 volte in
sedute
d t analitiche
liti h differenti
diff
ti con un CV del
d l 31.2%
31 2% (concentrazione
(
t i
media 23.6 pg/mL).
I valori
alori del LoB e del LoD,
LoD così calcolati,
calcolati sono quindi
q indi risultati
ris ltati
corrispondere rispettivamente a 18.0 pg/mL e 30.2 pg/mL di
aldosterone.
CALCOLO DEL VALORE DI LOB
RLU
Media -1.645
1.645 SD
SD= 117161
117161
LoB 18.0 pg/mL
Aldosterone, pg/mL
y = 131991 - 812 x
R= 0.947
N= 125
PROFILO DI IMPRECISIONE
Il profilo di imprecisione tra saggi (n=20) del metodo su
piattaforma LIAISON è stato calcolato prendendo in
considerazione i valori di 7 campioni di plasma EDTA con
concentrazioni medie di aldosterone da 23.6 pg/mL a 348.8
pg/mL, raccolti da campioni di soggetti adulti sani e
pazienti
i ti cardiopatici.
di
ti i
Il profilo di imprecisione è stato calcolato misurando tali
campioni, per 20 giorni lavorativi differenti, distribuiti
nell’arco di due mesi, utilizzando due lotti di calibratori
differenti.
I valori del limite di quantificazione (LoQ) al 20% CV e al
10% CV sono risultati corrispondere ad una concentrazione
di aldosterone pari a 40.0 pg/mL e 95.0 pg/mL,
rispettivamente.
PROFILO DI IMPRECISIONE
INDICI DI SENSIBILITA’ ANALITICA DEL
METODO LIAISON DELL’ALDOSTERONE
LoB
LoD
LoQ
LoQ
(pg/ml)
(pg/ml)
(10 CV%) (20 CV%)
18.0
30.2
95.0 pg
pg/mL 40.0 pg
pg/mL
PROFILO DI IMPRECISIONE E LOQ DEL METODO RIA
(utilizzando campioni distribuiti nella VEQ Immunocheck di QualiMedLab)
METODO LIAISON
AUTOMATIZZATO
LoQ
LoQ
(10 CV%)
(20 CV%)
95.0 pg/mL 40.0 pg/mL
RIPRODUCIBILITA’
La riproducibilità del metodo automatizzato LIAISON per l’aldosterone è
stata valutata in accordo con il protocollo CLSI EP5-A2, misurando, due
volte al ggiorno p
per 20 g
giornate lavorative consecutive,, 2 campioni
p
di p
plasma
EDTA (in doppio) con concentrazione media di aldosterone di 65.1 pg/mL
(campione A) e 139.4 pg/mL (campione B), rispettivamente.
Campioni
A
B
Media Imprecisione nel saggio Imprecisione totale
(pg/mL)
(CV %)
(CV %)
65.1
139.4
12.9
8.1
14.1
10.1
La riproducibilità del metodo RIA per l’aldosterone è stata valutata con il
controllo fornito dalla ditta per un periodo di 18 mesi in 46 run diversi.
Concentrazione media: 153.5
153 5 pg/mL
SD: 11.7 pg/mL
CV: 7.7 %
Confronto tra le sensibilità analitiche
dei due metodi automatizzati
METODO LIAISON
LoB
LoD
LoQ
(pg/mL)
(pg/mL)
(pg/mL)
18.0
30.2
40.0
METODO iSYS
LoB
LoD
LoQ
(
(pmol/L)
l/L)
(
(pmol/L)
l/L)
(
(pmol/L)
l/L)
19 1
19.1
33 2
33.2
37 6
37.6
(Fortunato A. et al. In press)
19
CONFRONTO DEI PROFILI DI IMPRECISIONE
DEI METODI AUTOMATIZZATI
(Fortunato A. et al. In press)
20
CONFRONTO TRA I RISULTATI CLINICI
Abbiamo dapprima confrontato i risultati ottenuti
con il metodo LIAISON con quelli del metodo RIA
ALDO-CTK (DiaSorin), attualmente utilizzato nel
nostro laboratorio, misurando la concentrazione di
aldosterone in 241 campioni plasmatici di soggetti
apparentemente sani e pazienti con malattie
cardiovascolari.
CONFRONTO METODO LIAISON CON RIA
CONFRONTO LIAISON CON IL
METODO RIA
I risultati dei due metodi risultano
correlati;
l ti tuttavia
t tt i il metodo
t d LIAISON
presenta una sottostima media rispetto al
metodo RIA del -11.2%
-11 2% (SD 118.2%,
118 2%
p<0.0001 con Wilcoxon Signed Rank test).
CONFRONTO METODO AUTOMATIZZATO CON RIA
CONFRONTO TRA I RISULTATI
OTTENUTI CON LE DUE
METODICHE AUTOMATIZZATE
Abbiamo poii confrontato
Abbi
f t t il metodo
t d che
h
utilizza la piattaforma LIAISON con il
metodo
t d che
h utilizza
tili
l piattaforma
la
i tt f
iSYS
iSYS,
misurando 294 campioni plasmatici di
soggetti apparentemente sani e pazienti con
malattie cardiovascolari.
CONFRONTO METODO LIAISON CON iSYS
CONFRONTO TRA I RISULTATI OTTENUTI
CON LE METODICHE AUTOMATIZZATE
Come abbiamo visto nella figura precedente,
precedente i due
metodi automatizzati mostrano risultati in ottimo
accordo tra di loro.
Tuttavia,, si rileva un bias significativo
g
((Wicoxon
signed rank test p<0.0001) tra i due metodi
[(LIAISON - iSYS)/iSYS %], per cui il metodo
LIAISON presenta mediamente una sovrastima
del 27.5% (SD 59.5) rispetto al metodo iSYS, come
sii rileva
il
meglio
li nella
ll seguente
t figura.
fi
CONFRONTO METODO LIAISON CON iSYS
Risultati ottenuti utilizzando campioni
di controllo
t ll esterno
t
di qualità
lità
I valori di aldosterone di 12 campioni di controllo
sono stati misurati con i due metodi automatizzati
LIAISON e iDYS nel nostro laboratorio e anche da
alcuni laboratori partecipanti alla VEQ di
QualiMedLab nel ciclo del 2013.
2013
Questi risultati sono stati confrontati con le medie
di controllo ottenute dai laboratori partecipanti
alla VEQ con tutti gli altri metodi RIA ed EIA più
diffusi in Italia.
Risultati ottenuti utilizzando campioni
di controllo esterno di qualità
Matrice di correlazione tra i valori di aldosterone misurati
dai laboratori partecipanti alla VEQ QualiMedLab in 12
campioni di controllo distribuiti nel ciclo annuale 2013
Abbiamo calcolato la matrice di correlazione tra le medie di
consenso dei risultati ottenuti con i vari metodi nei 12 campioni di
controllo distribuiti nella VEQ.
Tutti i metodi ad esclusione del RIA della ditta DRG Instruments
GMGH, hanno mostrato degli ottimi coefficienti di correlazione tra
di loro.
In particolare, i risultati ottenuti con i due metodi automattizzati
LIAISON e iDYS sono risultati molto ben correlati tra loro
(R=0.972).
Inoltre, il valore medio trovato con il metodo LIAISON (132.2±71.6
pg/mL)
/ L) non è risultato
i l
significativamente
i ifi i
diff
differente
(
(p=
0 2163
0.2163
con t test) da quello misurato con il metodo iDYS (146.6±103.4
31
pg/mL).
Matrice di correlazione tra i valori di aldosterone misurati
dai laboratori partecipanti alla VEQ QualiMedLab in 12
campioni di controllo distribuiti nel ciclo annuale 2013
Valutazione dei limiti di riferimento
nella popolazione normale
L’aldosterone
L’
ld t
è stato
t t
misurato,
i
t
con il metodo
t d
automatizzato LIAISON, in campioni di plasma
ottenuti dopo un riposo di 15 minuti in posizione seduta
da 147 soggetti apparentemente sani, di cui 59 maschi
(età 48.0 ± 11.7 anni i) e 88 femmine (età 51.0 ± 10.8
anni).
)
E’ stata trovata una differenza significativa (p= 0.0059
con il test non parametrico di Mann
Mann-Whitney)
Whitney) tra il
valore medio osservato nelle femmine (media ± SD=
110.7 ± 59.9 pg/mL, mediana 97.8 pg/mL) e quello
mis rato nei maschi (media ± SD=
misurato
SD 89.0
89 0 ± 50.3
50 3 pg/mL,
pg/mL
mediana 73.68 pg/mL).
Valori di aldosterone plasmatico in
soggetti adulti sani, divisi per genere
p= 0.0059
Valutazione dei limiti di riferimento
nella popolazione normale
Considerando la popolazione totale,
totale la media della
concentrazione dell’aldosterone è risultata essere di 102.2
pg/mL, la mediana 88.8 pg/ml ed il range interquartile di
64.1 – 131.8 pg/mL, mentre il 97.5° percentile è risultato
essere di 248.2 pg/mL ed il 2.5° percentile rispettivamente di
13.0 pg
pg/mL,, cioè inferiore al valore del bianco del metodo
(LoB).
Infine, è stata trovata una correlazione inversa significativa
Infine
tra i valori dell’età e la concentrazione di aldosterone (Rho=
-0.288, p= 0.0005 con il test di correlazione per ranghi di
S
Spearman).
)
DISTRIBUZIONE DEI VALORI DI PLASMA ALDOSTERONE
IN 147 SOGGETTI APPARENTEMENTE SANI
97.5 percentile
DISCUSSIONE
I metodi automatizzati, da noi valutati non
presentano alcune criticità che un metodo RIA
normalmente mostra, come:
a) necessità di raggruppare diversi campioni da
dosare in un’unica esperienza;
b) tempi lunghi di refertazione anche a causa
dell’incubazione
dell
incubazione overnight (mentre,
(mentre per contro,
contro il
tempo di risposta del metodo automatizzato è
inferiore ad un’ora);
c)) breve
b
d t della
durata
d ll scadenza
d
d i reagenti,
dei
ti con un
rapido ricambio dei materiali;
d) problematiche inerenti alle procedure di utilizzo e
di smaltimento dei rifiuti radioattivi.
DISCUSSIONE
Inoltre, entrambi i metodi automatizzati valutati
nel presente studio per la misura dell’aldosterone
mostrano risultati clinici correlati ai metodi non
automatizzati presenti attualmente nel mercato
automatizzati,
italiano, come dimostrano i risultati ottenuti dal
confronto con i dati più recenti della VEQ
Immunocheck.
Infine, i due metodi automatizzati presentano
performance analitiche tra loro del tutto
pragonabili.
pragonabili
CONCLUSIONI
In conclusione, entrambi i metodi automatizzati
per il dosaggio
d
i dell’aldosterone,
d ll’ ld t
che
h sono stati
t ti
valutati e confrontati in questo studio, mostrano
p
alle
alcune caratteristiche analitiche superiori
metodiche per competizione non automatizzate
attualmente in uso.
Quindi, questi metodi automatizzati risultano da
preferire ai classici metodi RIA od EIA non
p
automatizzati, soprattutto quando il dosaggio
dell’aldosterone è eseguito di norma solo in pochi
campioni ogni giorno e/o che è necessario fornire
una rapida risposta ai clinici.
I metodi di dosaggio dell’Aldosterone: una “Storia Antica”
UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PISA
Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia
Tesi di Laurea del Candidato
Aldo Clerico
Metodi di dosaggio dell’Aldosterone:
Considerazione generali e descrizione di una metodica originale
Pisa, 23 luglio 1973
Parafrasando l’ultima battuta di Rossella
O’Hara nel famoso film “Via col Vento”, si può
dire:
DOMANI E’ UN ALTRO …
METODO !
41
GRAZIE
E
PER
L’ATTENZIONE
L
ATTENZIONE !
Criticità nella misura dei metodi di
dosaggio dell’aldosterone
dell aldosterone
Aldo Clerico
Scuola Superiore Sant’Anna
Fondazione Regione Toscana G. Monasterio
clerico@ftgm.it

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