Development and validation of an UPLC-MS/MS method for Sildenafil and N-desmethysildenafil plasma determination and quantification Debora Pensi, Marco Simiele, Daniela Pasero, Francesca Ivaldi, Mauro Rinaldi, Giovanni Di Perri, Vito Marco Ranieri, Antonio D'Avolio Università degli Studi di Torino / ASL TO2 Dipartimento di Scienze Mediche, Malattie Infettive Laboratorio di Farmacologia Clinica e Farmacogenetica Padiglione Q, Ospedale Amedeo di Savoia, C.so Svizzera 164 10149 TORINO (Italy) Web Site: www.tdm-torino.org e-mail: info@tdm-torino.org UNI EN ISO 9001:2008 CERTIFIED LABORATORY Sildenafil 1986 : sintetizzato dalla Pfizer in Inghilterra come inibitore della fosfodiesterasi 5 (PDE5) 1996 : viagra brevettato dalla Pfizer 1998 : approvato dall’FDA per la cura della disfunzione erettile 2005 : approvato da FDA e EMA per il trattamento ipertensione polmonare arteriosa di classe II e III 2013 : termine del brevetto della Pfizer possibile commercializzazione di farmaci generici contenenti il sildenafil Sildenafil N-desmetilsildenafil ha il 50% della potenza del sildenafil Sildenafil e N-desmetilsildenafil sono inibitori selettivi delle fosfodiesterasi inibisce Non inibisce PDE 1 PDE 2 PDE 7 PDE 8 PDE 9 PDE 3 PDE 5 PDE 5 A1 875 aa PDE 6 PDE 5 A2 833 aa vescica, colon, prostata, corpo cavernoso, piccolo intestino, stomaco, condrociti, muscolatura liscia dei vasi Meccanismo d’azione del sildenafil NO Guanilato ciclasi 5’-GMP PDE cGMP Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ 4 Farmacodinamica Muscolo vascolare liscio riduzione transitoria della pressione sanguigna sistemica Piastrine azione antitrombotica aumento rischio emorragico Intestino riduzione traffico intestinale reflusso gastrico rilassamento sfintere gastro-esofageo Corpo cavernoso solo in seguito a stimolo sessuale rilascio di Ach NO ↑[cGMP] Vescica, Colon, Prostata, Placenta Retina (PDE-6) incapacità temporanea di distinguere blu-verde 5 Farmacocinetica Assorbimento somministrazione orale a digiuno a livello del tratto gastrointestinale 30-120 min raggiungimento Cmax TEMPO INFUSIONE = 15 min C max = 15 min T max = 15 min Infusione endovena Distribuzione Metabolismo Eliminazione volume di distribuzione SIL circa 105 L SIL e N-desmetil legati a proteine del plasma legano sostanza nera, pelle, retina SIL metabolizzato a livello epatico a N-desmetil metabolita secondario UK150,564 CYP3A4 e CYP2C9 anche l’N-desmetil viene metabolizzato eliminato principalmente nelle feci eliminazione in misura minore nelle urine tasso di eliminazione è 41L/h 6 Farmaci che possono interferire sulla farmacocinetica del sildenafil Bosentan Induttore del CYP3A4, co-somministrazione aumenta metabolismo sildenafil Cimetidina Inibitore CYP3A4, co-somministrazione induce aumento del 56% delle concentrazioni plasmatiche di sildenafil Eritromicina Inibitore CYP3A4, co-somministrazione induce aumento del 182% delle concentrazioni plasmatiche di sildenafil Indinavir Antiretrovitrale, co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil Ritonavir Antiretrovitrale, co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil Saquinavir Antiretrovitrale, co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil Beta-bloccanti Succo di pompelmo Co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil Co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil 7 PAH: ipertensione polmonare arteriosa Malattia rara (2/1000000 abitanti) Associata a malattie del connettivo, del fegato, HIV, cardiopatie congenite, trombo-embolia polmonare Aumento pressione polmonare Malattie del sistema vascolare (casi gravi) Stanchezza Sensazione di affanno Ritenzione liquidi Il cuore destro si dilata e non risulta più in grado di pompare sangue nel circolo polmonare Vita quotidiana compromessa 2013 termine del brevetto della Pfizer farmaci generici contenenti il sildenafil Indagini antidoping Assenza di metodi QUANTITATIVI dedicati Studio clinico 2013 (ancora in corso) presso La Città della Salute (presidio Molinette) di Torino Trattamento sildenafil di pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca per :PATOLOGIA DELLA VALVOLA MITRALE PRESENTANTI IPERTENSIONE POLMONARE SEVERA Scopo del lavoro Messa a punto e validazione di un metodo bioanalitico per la quantificazione plasmatica (con finalità cliniche) di sildenafil e Ndesmetilsildenafil adattabile alla pratica clinica rapido e preciso sensibile e specifico UPLC vs HPLC Velocità delle analisi aumentata di 2-3 volte rispetto all’HPLC Riduzione lunghezza colonna Riduzione dimensioni particelle Aumento delle pressioni da 6000 psi a 15000 psi Fasi stazionarie con particelle < a 2µm 15000 psi Efficienza separativa e alta risoluzione Sensibilità e produttività Controlli di Qualità e Curva di Calibrazione Concentrazioni uguali per sildenafil e N-desmetilsildenafil QC H QC M QC L 750 ng/mL 100 ng/mL 10 ng/mL Cal 9 Cal 1 1000 ng/mL 3,9 ng/mL Pensi et al.,2014 Submited Cromatogramma di un mix chimico (sildenafil, N-desmetilsildenafil e quinaxolina alla concentrazione di 10µg/mL) 6,06 min Run Time 10 minuti 5,11 min 5,06 min Pensi et al.,2014 Submited Validazione del metodo secondo linee guida FDA (2013) PRECISIONE Misura la distanza tra i vari valori misurati, espressa in CV% ACCURATEZZA Misura la distanza dei valori misurati dal valore vero STABILITA’ Calibratori, controlli di qualità, campioni devono essere stabili fino al momento delle analisi SPECIFICITA’ Capacità di riconoscere l’analita d’interesse senza interferenze da parte di altri farmaci LLOD Limite minimo di rilevazione (3 volte rumore di fondo) LLOQ Limite minimo di quantificazione (RSD<20%; 5 volte rumore di fondo) ULOQ Limite massimo di quantificazione Recupero Effetto matrice Efficienza della procedura estrattiva Rumore di fondo causato da analiti che competono con l’analita d’interesse sildenafil Risultati della sildenafil PRECISIONE QC H QC M QC L 1,2µg/mL FDA 160 ng/mL 16 % ng/mL CV < 15% LLOQ PLASMA BIANCO RICOSTITUITO validazione MIX CHIMICO RISULTATI QC M 5 prove intra-day :(8,26-2,58%) e 5 inter-day(1,02-3,25%) ACCURATEZZA < 15% -7,16% - 9,01% Curva di calibrazione deviazione % dalla conc nominale <15%, per Cal 1 <20%; Coefficiente di regressione >0,995 STABILITA’ _ SPECIFICITA’ No interferenze LLOQ RSD%<20% ; almeno 5 volte rumore di fondo 3,9 ng/mL (= CAL1) LLOD almeno 3 volte rumore di fondo 1,95 ng/mL (diluizione 1:1 CAL 1) RECUPERO Costante per ogni campione (>70%) Effetto Matrice Assente (<20%) LLOD r2 = 0,995-0,999 Deviazione % dalla concentrazione nominale <15%, per tutti i calibratori Vos et al., 2008 : stabili per 6 mesi a -20°C 6 campioni di plasma bianco, senza interferenze Recupero medio per sildenafil 83,2% Recupero medio per N-desmetilsildenafil 84,5% 6 campioni di plasma bianco ricostituiti, deviazione percentuale 3-4 % effetto matrice <15% Pensi et al.,2014 Submited Applicazione del metodo 20 pazienti dell’ospedale La Città della Salute presidio Molinette (studio clinico di Fase III) somministrati 10 mg di sildenafil per via endovenosa (ogni 8 h per un massimo di 72h) Prelievi ematici T0 T1 T2 T3 T4 -15 min (Ctrough) 20 min (Cmax) 1h 4h 8h 1° infusione steady state I valori delle concentrazioni plasmatiche dei Tutti i campioni dei pazienti sono stati analizzati in doppio pazienti rientrano nei range di curva Pensi et al.,2014 Submited Parametri farmacocinetici allo steady-state dei pazienti analizzati Cmin Concentrazione più bassa di farmaco nel plasma tra una somministrazione e l’altra Cmax Concentrazione più alta di farmaco nel plasma tra una somministrazione e l’altra AUC Area sottesa alla curva nella concentrazione plasmatica nel tempo emivita (t1/2) tempo di dimezzamento necessario affinchè la concentrazione plasmatica di farmaco si dimezzi Volume distribuzione Valore correlato alla concentrazione plasmatica rispetto alla concentrazione totale di farmaco sildenafil N-desmetil 38.0 ng/mL [31.7-93,0] 52,50 ng/mL [38,75-85,75] 328,50 ng/mL [177,0-475,2] 74.0 ng/mL [55,7-101,5] 655,7 h*ng/mL [535,9-1249,9] 493,5 h*ng/mL [352,83-717,8] 5,1 h [4,0-5,5] 15.4 h [14,7-15,7] 75,2 L [57-128] 403,3L [385-615] Pensi et al.,2014 Submited Conclusioni primo metodo sviluppato su sistema UPLC-MS/MS seguite le norme UNI EN ISO 9001: 2008 (progettazione e sviluppo metodi) validazione del metodo seguendo le linee guida FDA 2013 separazione efficace del sildenafil da N-desmetilsidenafil (metodo molto specifico) alta sensibilità (nonostante il piccolo volume di plasma) assenza di effetto matrice e buon recupero rapidità e affidabilità: analisi adatta alla pratica clinica Conclusioni tutte queste caratteristiche rendono questo metodo utilizzabile nella routine di laboratorio e, in base alle necessità dei clinici, per un futuro TDM plasmatico del sildenafil Sviluppi futuri di questo lavoro Ricerca dei polimorfismi genetici che correlino con le concentrazioni plasmatiche degli analiti in oggetto: per prevedere a priori le concentrazioni del sildenafil e del suo metabolita per spiegare le eventuali differenze inter-paziente applicazione di tale metodo anche ad indagini anti-doping Grazie per l’attenzione
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