京都大学新技術説明会（2014.05.27）ヒトES/iPS細胞のハイスループット３D培養法亀井謙一郎（博士（工学）、特定拠点助教）陳勇（Ph.D.、特定拠点教授）京都大学物質ー細胞統合システム拠点 1 ヒト多能性幹細胞とは？ Blastcyst Somatic cells Inner cell mass Reprogramming Factors Oct-4, Sox-2, Klf-4 (c-Myc) Propagation in culture hESC 自己複製 hiPSC Human Pluripotent Stem Cell (hPSC) Neuron Pancreas Muscle Blood 分化 2 細胞外微小環境：生体の細胞機能制御システム不溶性因子自己複製幹細胞分化遊走細胞間相互作用可溶性因子プログラム死など… 3 マイクロ流体デバイスを細胞生物学に応用する利点マイクロ流体技術は細胞外微小環境を人工的に作製するために、必要な技術である。     細胞培養の3次元構造を創出: 不溶性因子微小液滴（ｆL〜ｎL）を制御可能: 可溶性因子 MEMS技術と組み合わせることによって、細胞挙動解析が可能実験のハイスループット化が可能ヒトES/iPS培養デバイス Kamei et al., Lab Chip, 2009 Kamei et al., Lab Chip, 2010 ヒドロゲルとマイクロ流体デバイスを組み合わせることによって、３次元培養を可能にした。ヒトES/iPS細胞をヒドロゲル+マイクロ流体デバイスの中で、培養することができた。熱応答相転移ヒドロゲルヒトiPS細胞未分化状態 Sol % of Max 100 Gel 80 95.1 60 40 20 Low （0〜15℃） High （> 25˚C） Cell: 253G1 hiPSC Medium: mTeSR-1 Period: 10 days 0 100 101 102 103 104 SSEA4 ゲルの濃度を変えることで、3次元環境の「固さ」も変えることが可能。物質の拡散をコントロールしながら、細胞に与える影響を試験できる FITC-Dextran（モデル分子）のゲル中の拡散 0 min 3~5 kDa 45 min 90 min 40 kDa 0 2000 入口からの距離 (µm) 従来の細胞培養ディッシュでは、このような実験を行うことが出来なかった。ハイスループット３D環境＋薬剤スクリーニング 3次元細胞環境をスクリーニングすることができる。＋薬剤の細胞機能への効果をより正確に評価することができる。ハイスループットマイクロ流体デバイス 3次元環境＋化学物質  コンビナトリアル「環境」ライブラリ  組織工学に応用可能  96穴プレートと同じデザイン自動化ピペッター  スクリーニングの自動化が可能新技術の特徴・従来技術との比較 • 従来技術と比較し、ヒトES/iPS細胞の3次元培養を可能にした。 • 一つのプレート（デバイス）内で、物理的・化学的なパラメーターを試験することが可能。 • 可溶性物質の濃度勾配も作製することが可能。 • ヒトES/iPS細胞実験は、無血清・無フィーダー細胞で行なっており、より実用化に近い状態で実験を行える。想定される用途 • 本技術の特徴は3次元培養環境をスクリーニング・同定することができることであり、ヒトES/iPS細胞からの分化誘導・組織形成試験に使用することができる。 • 組織工学のさらなる発展に貢献することができる。 • 創薬スクリーニングにおいても、本来の細胞環境に近い状態でスクリーニングでき、前臨床試験に適している。 • ヒトES/iPS細胞に限らず、様々な細胞に応用可能。 • がん幹細胞研究や、それを目的とする創薬開発にも貢献することが規定できる。実用化に向けた課題 • 現在、デバイスのプロトタイプは完成している。如何に、大量生産するか、が鍵となる。 • 今後、未分化細胞だけでなく、分化細胞、分化誘導なども検討していく。 • スクリーニングの際の、細胞応答の測定法も併せて検討していく。企業への期待 • マイクロ流体デバイスの量産化技術により、よりコスト削減が可能 • 化合物スクリーニングの新規展開を考えている企業との共同研究を希望 • 新規細胞アッセイ系の開発を行っている企業との共同研究も可能 • 従来の細胞アッセイ系にも、本技術が応用可能であり、キットとしての製品化が可能であると思われる。本技術に関する知的財産権 • 発明の名称：細胞培養足場基材、マイクロ流体デバイス及びそれを用いたハイスループットナノファイバースクリーニング方法 • 出願番号：特願2013-263585 • 出願人：京都大学 • 発明者：亀井謙一郎、眞下泰正、劉莉、陳勇 • 発明の名称：マイクロ流体デバイスを用いたヒト多能性幹細胞の微小3次元培養法 • 出願番号：特願2014-034166 • 出願人：京都大学 • 発明者：亀井謙一郎、陳勇お問い合わせ先関西TLO（株）星安紗希【京大オフィス】 TEL : 075-753-9150 FAX : 075-753-9169 【京都駅前オフィス】 TEL：075-353-5890 FAX ：075-353-5891 E-mail：hoshiyasu@kansai-tlo.co.jp